Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución.

Abstract

La proteómica es un enfoque de uso común que puede proporcionar conocimientos sobre los sistemas biológicos complejos. El epitelio sensorial coclear contiene receptores que transducen la energía mecánica del sonido en una energía electro-química procesada por los sistemas nerviosos periférico y central. Varias técnicas de proteómica se han desarrollado para estudiar el oído interno coclear, tales como la electroforesis bidimensional en gel de diferencia (2D-DIGE), microarrays de anticuerpos, y espectrometría de masas (MS). MS es la herramienta más completa y versátil en proteómica y en conjunto con los métodos de separación puede proporcionar un proteoma en profundidad de las muestras biológicas. Métodos de separación combinadas con EM tiene la capacidad de enriquecer las muestras de proteínas, detección de bajo peso molecular y proteínas hidrofóbicas, y identificar las proteínas de baja abundancia mediante la reducción de la gama dinámica proteoma. Diferentes estrategias de digestión se pueden aplicar a toda lisado o a proteínas de lisado fraccionado para mejorar péptido y proteínascobertura de secuencia. La utilización de diferentes técnicas de separación, incluyendo intercambio catiónico fuerte (SCX), de fase inversa (RP), y la electroforesis en gel de fracción de atrapamiento de líquido-se eluyó (GELFrEE) se puede aplicar para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis de MS para la identificación de proteínas.

Introduction

La proteómica es el estudio de sistemas biológicos complejos mediante el análisis de la expresión de proteínas, la función, las modificaciones y las interacciones 1. Varios métodos han sido utilizados para el análisis del proteoma del oído interno, incluyendo el anticuerpo de microarrays 2, electroforesis bidimensional en gel de 3-5, y DIGE 6. Sin embargo, sólo un número limitado de proteínas se han identificado y caracterizado 2,7-10, en comparación con los más de 10.000 genes y las etiquetas de secuencias expresadas (EST) identificados en el oído interno 11,12, MS es la técnica más utilizada integral y en proteómica para la caracterización de proteínas. Análisis de muestras proteómicos complejas, tales como la cóclea, puede ser un reto. Sin embargo, la combinación de múltiples técnicas de separación con MS permite la identificación de un mayor número de péptidos y proteínas, debido a un mayor rango dinámico y la capacidad de concentración pico 13. Cro MultidimensionalPHY reduce mezclas de proteínas altamente complejas, al permitir el uso de diferentes mecanismos de adsorción. Hay dos enfoques de análisis MS proteoma de uso común, la escopeta y la proteómica de abajo hacia arriba. En proteómica escopeta, una mezcla de proteínas intactas se digiere enzimáticamente y se separó mediante cromatografía multidimensional con fuerte cromatografía de intercambio catiónico (SCX), seguido de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC) 14,15. Los péptidos separados son sometidas a tándem MS y base de datos de búsqueda 15. Una ventaja principal de esta técnica es que miles de proteínas pueden ser identificadas en un solo análisis y la técnica es más adecuada para las proteínas de membrana.

En el enfoque de abajo arriba, la mezcla de proteínas se separa, por lo general por una o electroforesis de dos dimensiones, y las bandas de proteínas individuales o puntos cortado y digerido con una enzima tal como tripsina, por lo general resulta en múltiples péptidos. Sin embargo, otra más recientely desarrolló enfoque electroforética, utilizado en la proteómica de abajo hacia arriba, es GELFrEE. Esta técnica fracciona muestras de proteínas en fase líquida y los hace menos complejo antes del análisis. Esta técnica es reproducible, ofrece una alta recuperación de proteína, y reduce la distribución de las proteínas abundantes altas en las muestras de proteínas complejas 16. Péptidos derivados de proteínas separadas, se analizan por EM, mediante el uso de huellas másicas de péptidos o MS en tándem (MS / MS), para crear etiquetas de secuencia para la búsqueda de base de datos 17-19. Algunas de las principales ventajas de utilizar el enfoque de abajo hacia arriba son la capacidad de obtener separaciones de alta resolución y cobertura de la proteína completa. Proteómica abajo hacia arriba es la técnica más utilizada en proteómica 20, por lo tanto, varias herramientas bioinformáticas disponibles. Además, las proteínas se pueden separar en una mezcla compleja antes de la digestión, por lo que hay una mayor probabilidad de identificación.

Uno de los principales retosen el uso de el oído interno para el análisis proteómico es su pequeño tamaño, accesibilidad restringida, y el tipo de células diversidad 21. Además, las proteínas clave que distinguen su funcionalidad, tales como los canales iónicos, transportadores y receptores, son proteínas de membrana, que pueden ser difíciles de aislar 22. Por lo tanto, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) es ventajoso para los análisis proteómicos de tejidos que están limitados para la extracción de la proteína y que requieren detergentes para solubilizar las membranas 23. Este filtrado permite el análisis de MS de membrana y proteínas solubles y para la capacidad de aislar péptidos a partir de los contaminantes de bajo peso molecular 23,24.

El presente protocolo describe enfoques proteómicos comúnmente utilizados que se combinan y modificar para analizar proteínas tanto solubles y de membrana y para maximizar el número de ID de la proteína a partir del epitelio sensorial coclear. Vamos a describir el uso de la proteómica escopeta con FASP múltiples digeririónico, cromatografía de intercambio iónico, MS de alta resolución, y el análisis de datos. Además, vamos a describir la proteómica de abajo hacia arriba con GELFrEE, FASP multi-digestión, MS de alta resolución, y el análisis de datos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Declaración de Ética

Los experimentos con tejido de ratones fueron aprobados por la Universidad del Sur de Florida Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Protocolos 3931R, 3482R) como se establece en virtud de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Extracción de proteínas

  1. Aislar epitelio sensorial coclear de 16 a 30 días de edad (P30) CBA / J ratones y almacenar a -80 ° C.
  2. En el día del experimento, lavar el tejido con 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS). Se centrifuga durante 3 minutos a 1.000 xg, y eliminar el sobrenadante. Repita la operación para un total de tres lavados.
  3. Tejido Someter a ultrasonidos durante 30 segundos en hielo en 100 l de tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 120 mM, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 500 mg / ml de AEBSF, 10 mg / ml de leupeptina, 100 g / ml de pepstatina, 2 mg / ml de aprotinina, y 0,5 mg / ml utilizando un microcistina Dismembrator sónica (Modelo 100; Thermo Fisher). Lisado Enfriar en hielodurante 1 min entre cada sonicación. Sonicar un total de 3 veces.
  4. Centrifugar la solución a 750 xga 4 ° C durante 2 min y separar el sobrenadante a un nuevo microtubo. Extraer el precipitado en 50 l de tampón de lisis por sonicación durante 30 segundos en hielo. Centrifugar la solución a 750 xga 4 º C durante 2 min. Combinar ambos lisados ​​y centrifugar a 28.600 xga 4 º C durante 60 min. Eliminar el sobrenadante a un nuevo microtubo y añadir tampón de lisis 20 l que contiene 0,1% de ASB-14 al sedimento. Vortex durante 1 min y se incuba durante 60 min a 4 ° C.
  5. Calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min, luego se enfría a 4 ° C durante 60 min. Siga con centrifugación a 16.000 xg a 25 º C durante 10 min. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo.
  6. Centrifugar la suspensión a 16.000 xg a 4 ° C durante 5 min y retener el sobrenadante para la digestión.

2. Doble digestión de la proteína trípticos de Todo el lisado Usando FASP

  1. Añadir un 30 μl alícuota (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear, que contiene 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 100 mM de Tris-HCl, pH 7,6 y 0,1 M de ditiotreitol (DTT) directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de 8 M de urea en Tris-HCl. Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min.
  2. Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min.
  3. Añadir 10 l de 10x yodoacetamida (IAA) en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 min a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad, seguido por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min.
  4. Añadir 100 l de solución 8 M de urea al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de bicarbonato de amonio 50 mM de solución (ABC) a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x.
  5. Añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) de la enzima a--Ratio proteína y se incuba durante la noche (O / N) a 37 ° C.
  6. Después de la incubación, añadir 40 l de 50 mM de solución de ABC para filtrar unidad y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
  7. Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo fresco y acidificar con ácido fórmico (FA) al 1,0% para detener la digestión.
  8. Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua.
  9. Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C.
  10. Eluir péptidos trípticos de la segunda digerir mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
  11. Añadir 50 l de solución de NaCl 0,5 M a launidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con FA a 1,0%.
  12. Las muestras se pueden cuantificar utilizando el ensayo colorimétrico de microplacas utilizando BSA como estándar.

3. Endoproteinasa LysC y tríptica Proteína La digestión de Whole lisado Usando FASP

  1. Añadir una alícuota de 30 l (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear que contiene 4% de SDS, Tris-HCl 100, pH 7,6 y 0,1 M DTT directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl . Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min.
  2. Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min.
  3. Añadir 10 l de 10x IAA en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se centrifuga a 14000 × g durante 10 min.
  4. Añadir 100 l de sol 8 M urealución al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x.
  5. Añadir 0,1 g / l de endoproteinasa LysC en un 01:50 (w / w) Relación de enzima a proteína y se incuban O / N a 30 ° C.
  6. Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
  7. Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos lysC a un microtubo fresco y acidificar con FA a 1,0% para detener la digestión.
  8. Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua.
  9. Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final, se añadirán 0,4 g / l de tripsina 1:100 en-enzima-a Prorelación de proteína e incubar O / N a 37 ° C.
  10. Eluir péptidos trípticos mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
  11. Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con 1,0% FA.
  12. La muestra puede ser cuantificada usando el ensayo colorimétrico de microplacas con BSA como estándar.

4. Péptidos desalado el uso de columnas de Spin

  1. Activar una columna C 18 MacroSpin mediante la adición de 500 l de acetonitrilo (ACN) y se centrifuga a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo continuo después de la centrifugación.
  2. Equilibrar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el filtrado y repita este paso 1x.
  3. Agregue hasta 500 l de péptido digerir a la de una columnad centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Si el volumen de la muestra es superior a 500 l continuación, repita este paso.
  4. Lavar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo directo. Repita este paso 1x.
  5. Añadir 250 l de una relación de 90:10 a-ACN-a agua a la columna y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Recoger el eluyente que contiene los péptidos desalado y traslado a un microtubo fresco. Repita este paso 1x.
  6. Secar la muestra de péptido desalado en una centrífuga de vacío y evitar que la muestra se seque por completo.

5. Cromatografía de intercambio iónico

  1. Inyectar 50-100 g de muestra de proteína digerida en un 200 x 2,1 mm, columna SCX m 5 (Polysulfoethyl A) para separar los péptidos.
  2. Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 50 min con una velocidad de flujo de 250 l / min. El disolvente A es formiato de amonio 5 mM, pH 3,0 en 25% de acetonitrilo y 75% ddH 2 O. Disolvente B es formiato de amonio 500 mM, pH6,0 en el 25% y el 75% ACN ddH 2 O.
  3. Monitorear las fracciones de péptidos a 280 nm y recoger las fracciones en intervalos de 2 min utilizando un colector de fracciones.
  4. Fracciones secas en un concentrador de vacío y resuspender en 500 l de acetonitrilo al 50% en ddH2O contiene 5% de FA para ayudar en la extracción de sal.
  5. Fracciones resecar y almacenarlos a -80 ° C hasta su utilización para el análisis LC-MS/MS nano.

6. Precipitación con acetona

Antes de la separación GELFrEE el sobrenadante proteína coclear tiene que ser desalada. Precipitación con acetona se puede utilizar para desalar y concentrar las proteínas.

  1. Añadir tres volúmenes de acetona helada al sobrenadante coclear. Agite suavemente y se incuba a 20 ° CO / N.
  2. Centrifugar la mezcla de la muestra a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante.
  3. Lavar el 3x proteína de pellets con acetona fría y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min a 4° C.
  4. Aire secar el pellet y se disuelven en 112 l de 18 MΩ agua.
  5. Determinar la concentración de proteína usando el ensayo colorimétrico de microplacas.

7. GELFrEE Fraccionamiento de coclear sensorial Epitelio

  1. Añadir 30 l de 5x tampón de muestra (0,25 M de Tris-HCl, pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% de glicerol, 0,5% (w / v) de azul de bromofenol) a la proteína desalada en suspensión en 112 l de 18 MΩ agua.
  2. Añadir 8 l de DTT 1 M y se calienta a 95 ° C durante 5 minutos para reducir los enlaces disulfuro de la proteína. Después de calentar permitir enfriar a temperatura ambiente.
  3. Añadir 8 ml de tampón de depósito de ánodo, 150 l de tampón de probar la cámara de recolección, y 6 ml de tampón de depósito de cátodo.
  4. Retire cualquier búfer que puede haber fluido en la cámara de muestra de carga utilizando una pipeta.
  5. Carga 150 l (≤ 1 mg) de la mezcla de proteínas coclear, en la cámara de muestra de carga utilizando un 8% Tres-acetato de cartucho con un intervalo de masa de 3,5 a 150 kDa.
  6. Electrodos más bajas y la tapa del instrumento para iniciar la carrera.
  7. En el primer tiempo de pausa en el instrumento añadir 2 ml de tampón al depósito catódico y reanudar plazo.
  8. En cada intervalo de pausa en el instrumento, recoger la muestra de la cámara de recolección de la muestra con una pipeta y añadir a un microtubo recién etiquetados. Lávese las 2x cámara colección con 150 l de tampón y deseche.
  9. Añadir 150 l de tampón dulce corriente a la cámara de recogida de muestras y reanudar la ejecución. Reunir las fracciones de proteína durante un periodo de tiempo de 2,6 horas en un volumen total de 150 l / fracción.

8. Gel Electroforesis 1D de GELFrEE fracciones

Electroforesis en gel de 1D puede utilizarse para visualizar los resultados de GELFrEE fraccionamiento antes de la digestión enzimática y el análisis de MS. Fracciones de proteína GELFrEE se pueden separar en un gel de Tris-HCl 4-15%.

  • Mezcle una alícuota de 5 l de cada fracción GELFrEE con 5 l de muestra de tampón de dilución (DTT 350 mM en tampón de muestra).
  • Calentar las muestras a 95 ° C durante 3 min.
  • Muestras de enfriar a ta.
  • De carga 10 l de cada fracción GELFrEE en carriles de gel individuales y de carga 5 l de estándar de peso molecular en el último carril no utilizado.
  • Correr el gel a 125 V durante 1,5 horas o hasta que el frente del colorante llega a la parte inferior del gel.
  • Retire con cuidado el gel y teñir con Silver Stain Plus para visualizar la separación de proteínas.

    • 9. Proteína La digestión de las fracciones GELFrEE Uso FASP

    Un procedimiento FASP modificado se utiliza para la eliminación del detergente y la digestión de las fracciones GELFrEE.

    1. Añadir cada fracción individual directamente a una unidad de filtro de 30K; mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl y se centrifuga a 14.000 xg durante 25 min.
    2. Diluir el concentrado con 200 l de solución de ureay se centrifuga a 14.000 xg durante 12 min. Repita este paso 1x.
    3. Añadir 10 l de 10x IAA en solución de urea al concentrado en cada unidad de filtro, de vórtice durante 1 min, y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad.
    4. Añadir 100 l de solución de urea al concentrado en las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC para las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x.
    5. Añadir 0,1 g / l de LysC para un 1:50 (W / W) Relación de enzima a la proteína a las unidades de filtro y se incuba O / N a 30 º C.
    6. Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC para los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
    7. Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos LysC de cada filtro de selección para un microtubo nuevo y se acidifica con trifluoroacácido etic (TFA).
    8. Lavar los filtros de spin con 40 l de urea 8 M, luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua.
    9. Lavar los filtros de spin 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en un 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C.
    10. Eluir péptidos trípticos de cada unidad de filtro mediante la adición de 40 l de 50 mM de solución de ABC y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x.
    11. Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos de cada unidad de filtro a un microtubo fresco y acidificar con TFA.
    12. Seque todas las digestiones en un concentrador de vacío.

    10. Preparación de muestras para LC-MS/MS

    1. LysC Reconstituir seca y péptido tríptico digiere fracciones en 20 l de 0,1% FA y agitar.
    2. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 10min y retirar el 95% superior de la muestra a un nuevo vial de muestra.
    3. Inyectar 5 l de cada fracción de péptido en una trampa 100 micras muestra x 25 mm para eliminar las sales y contaminantes y realizar la separación cromatográfica en una columna de 75 m 18 × 10 cm C.
    4. Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 100 min con una velocidad de flujo de 200 nl / min. El disolvente A es 95% ddH2O y acetonitrilo 5% que contiene 0,1% FA. Disolvente B es 80% de ACN y 20% ddH2O que contiene 0,1% FA.
    5. Recoge diez espectros de masas en tándem para cada MS escanear en un espectrómetro de masas de alta resolución. Un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap se utilizó en este experimento.

    11. Identificación de proteínas

    1. Identificar las proteínas utilizando la base de datos del ratón UniProt contiene tanto avance y retroceso secuencias de proteínas y contaminantes comunes. Software MaxQuant con motor de búsqueda MASCOTA se utiliza para buscar en la base de datos de proteínas.
    2. Los parámetros de búsqueda que se pueden utilizar incluyen; MODIFIC fijoación de Carbamidomethyl de cisteína, modificaciones variables de la oxidación de la metionina, la proteína acetilación N-terminal, máximo de 2 perdió la escisión. El péptido de longitud mínima para considerar para su identificación son 6 aminoácidos. Introduzca un error de concentración de masa de péptido ± 8 ppm y una tolerancia de masa fragmento de 1,2 Da (error de masa depende de la espectrómetro de masas que se utiliza).
    3. En el software MaxQuant, use un falso descubrimiento tasa del 1% (FDR) para la identificación de péptidos y proteínas. Identificación de proteínas está en la lista con el número de péptidos emparejados, la cobertura de secuencia por ciento de proteína, y las secuencias de péptidos.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Para obtener el proteoma más completa del epitelio sensorial coclear, se requiere la disección de tejidos rápida antes de la extracción de proteínas y preparación de la muestra. Dos técnicas de proteómica se pueden utilizar, de escopeta y de abajo hacia arriba la proteómica. Para preparar las muestras para la proteómica de escopeta, se utilizó procedimiento de digestión FASP como se ilustra en la Figura 1. El método permite FASP para la concentración de proteínas, la eliminación de los detergentes, y la digestión de proteínas usando múltiples enzimas. Había dos procedimientos de digestión doble de segunda mano, la primera fue una digestión tríptica seguida de una segunda digestión con tripsina, que se reunió, se fraccionó en una columna SCX en 18 fracciones y se analizaron por LC-MS/MS nano. Un total de 1.485 proteínas se identificaron con un FDR 1% cuando se realiza una sola ejecutar LC-MS/MS usando este enfoque experimental. Entre las proteínas identificadas, 329 y 258 se clasificaron las proteínas en la mitocondria y la membrana plasmática, respectivamente (figura2A). El segundo procedimiento de doble digestión consistió en la digestión LysC seguido por digestión con tripsina. Cada digestión se cargó de forma individual y se separó en la columna de la SCX en 18 fracciones y se analizó por LC-MS/MS nano. Los resultados de la LysC y digestiones de tripsina produjeron un total de 3.503 proteínas con un 1% FDR. Figura 2B muestra que 605 y 617 proteínas se clasifican en mitocondria y la membrana de plasma, respectivamente. Este enfoque proporciona el mayor número de ID de proteínas asociadas a la membrana. El análisis por duplicado del LysC y fracciones de tripsina mostró que más de 65% de las proteínas identificadas fueron compartidas entre los experimentos. Sin embargo, también hubo proteínas recientemente identificadas en el análisis repetidos. Los péptidos y proteínas adicionales fueron identificados debido a pequeños cambios en la cromatografía, por lo tanto, dando lugar a diferentes péptidos de fragmentación 25.

    Proteómica ascendentes se aplicó empleando fraccionamiento GELFrEEantes de LC-MS/MS como se ilustra en la Figura 3. Hubo 12 fracciones GELFrEE recogidos. Antes de la digestión y análisis LC-MS/MS, un gel teñido con plata estaba preparado para visualizar los resultados de GELFrEE fraccionamiento como se ilustra en la Figura 4. El gel mostró separación de proteínas mediante el aumento de peso molecular para cada fracción consecutivo. Por lo tanto, se digirieron las 12 fracciones líquidas GELFrEE usando dos enfoques de digestión de múltiples FASP diferentes y se analizaron por LC-MS/MS. El primer enfoque digestión se realizó con un doble digestión con tripsina, que condujo a la identificación de proteínas 2165 con un 1% FDR cuando se realiza una LC-MS/MS-sola pasada. Figura 5A muestra que hubo 516 y 399 proteínas clasifican en mitocondria y la membrana de plasma, respectivamente. El segundo enfoque de la digestión se realizó utilizando endoproteinasa LysC seguido por digestión con tripsina. Análisis LC-MS/MS Single-run identificó 2.211 proteínas con un FDR 1%. Esteenfoque mostró un número similar de proteínas asociadas a la membrana que cuando se utiliza el enfoque de tripsina / tripsina (Figura 5B). Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado al Consorcio ProteomeXchange 26 con el identificador del conjunto de datos PXD000231 25. Combinando los resultados de las diferentes técnicas resultaron en un gran número de membrana y proteínas solubles de la cóclea del ratón epitelio sensorial (Figura 6).

    Figura 1
    Figura 1. Esquema de una escopeta experimento proteómicos usando FASP, cromatografía de intercambio iónico, y de alta resolución MS. Las proteínas se extraen, solubilizado, y digerido usando FASP con LysC y endoproteinasas de tripsina. El LysC (tubo verde) y los péptidos trípticos (púrpura tubo) se separan en fracciones menos complejas utilizando cromatografía SCX y se analizó usando LC-MS/MS nano. El motor de búsqueda MASCOTA se utilizó para procesar los datos de MS para la identificación de proteínas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    Figura 2
    Figura 2. GO perfil componentes celulares de ID de la proteína cuando se realiza una (A) primero y segundo de la digestión con tripsina seguido de la separación SCX y (B) primero digestión con LysC seguido por una segunda digestión con tripsina seguido de la separación SCX. Todas las categorías se cuentan no exclusiva, cuando una proteína tiene más de una categoría de componentes celulares.es.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    Figura 3
    Proteínas Figura 3. Esquema de un ascendente experimento proteómicos usando GELFrEE, FASP, y de alta resolución MS. Extraídos se solubiliza y las proteínas se precipitaron con acetona (tubo azul) para eliminar las sales y contaminantes no deseados del lisado. El sedimento de proteína se solubiliza y proteínas fraccionó usando GELFrEE. Cada fracción fue digerido utilizando FASP con LysC y endoproteinasas de tripsina. El LysC (tubos verdes) y los péptidos trípticos (tubos púrpuras) de cada fracción se analizó utilizando LC-MS/MS nano y las proteínas identificadas mediante la búsqueda de datos MS utilizando MASCOTA. Haz clic aquí para ver en grande r imagen.

    Figura 4
    Figura 4. Gel de plata-manchado de fracciones GELFrEE epitelio sensoriales cocleares, para visualizar la separación de proteínas en cada fracción antes del análisis de MS. (M) marcador de proteína, (1) Fracción 1, (3) Fracción 2, (5) Fracción 5, (7) Fracción 7, (8) Fracción 8, (9) Fracción 9, (10) Fracción 10, (11) Fracción 11, (12) Fracción 12. Reproducido (adaptado) con permiso de Darville y Sokolowski 24. Derechos de autor 2013 por la Sociedad Americana de Química. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Figura 5. GO perfil componentes celulares de ID de la proteína cuando se realiza una (A) primero y segundo de la digestión con tripsina después de la separación GELFrEE y (B) primero digestión con LysC seguido por una segunda digestión con tripsina después de la separación GELFrEE. Todas las categorías se cuentan de manera no exclusiva, cuando una proteína tiene más de una categoría de componentes celulares. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

    La figura 6
    Figura 6. GO perfil componentes celulares para todas las proteínas identificadas mediante SCX, CERA, o separación GELFrEE. Cuando una proteína tenía más de una categoría de componentes celulares, todos los de su categorías se contaron no exclusiva. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Los pasos clave para maximizar la identificación de proteínas a partir del epitelio sensorial coclear son: 1) el uso de múltiples endoproteinasas para la digestión, 2) uso de múltiples técnicas de separación, y 3) la utilización de un espectrómetro de masas de alta resolución. La aplicación de múltiples enzimas aumenta el número de péptidos y mejora la cobertura de secuencia de la proteína, por lo tanto, mejorar el número de proteínas identificadas a partir del tejido coclear. Tripsina, la proteasa más utilizado proporciona una escisión eficaz y específica de proteínas, generando péptidos que son buenas para la EM de ionización y fragmentación. Sin embargo, el uso de otra enzima antes de la tripsina, tales como LysC, que también escinde en el residuo de lisina, proporciona la escisión del péptido más eficiente. Se observó que la cobertura de secuencia de las proteínas generadas a partir de la digestión LysC / tripsina mostró un aumento de la proteína de cobertura de secuencia relativa a la cobertura de secuencia de la proteína de la tripsina / digestión con tripsina.

    ove_content "> aplicación de la separación multidimensional antes de la MS reduce la alta complejidad de la muestra coclear en el enfoque proteómico escopeta. Esto permitió la identificación de varias proteínas, incluyendo proteínas de membrana, que son típicamente difíciles de identificar. Se identificó un mayor número de proteínas de membrana utilizando el enfoque de escopeta en contraposición con el enfoque de abajo hacia arriba. Sin embargo, el enfoque de abajo hacia arriba usando GELFrEE permitido para la identificación de proteínas abundantes más bajos. Esto se debe al aislamiento de proteínas de mayor abundancia, como Cochlin de la cóclea, en particular fracciones.

    Los datos de alta calidad obtenidos en el presente protocolo por un espectrómetro de masas de alta resolución, tal como un LTQ-Orbitrap, mejora y aumenta el número de proteínas que se pueden identificar en la cóclea. El LTQ-Orbitrap ofrece alta resolución, alta exactitud de masa, y alta sensibilidad para el análisis de péptidos. Por lo tanto, la aplicación de este instrumento ENABLes identificación de proteínas a partir de muestras biológicas complejas, tales como el epitelio sensorial coclear y mejora la identificación de péptidos de baja abundancia. La utilización de estos enfoques experimentales combinados con la poderosa herramienta de MS ayuda a aumentar significativamente el conjunto de datos de proteínas coclear, por lo tanto mejorando la oportunidad de identificar nuevos biomarcadores de proteínas que participan en la audición y la sordera.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

    Acknowledgments

    Los autores agradecen al Dr. Kent Seeley, Director del Centro para el Descubrimiento de Medicamentos e Innovación (CDDI) Facilidad de Proteómica de la Universidad del Sur de Florida para el uso de este servicio. Este trabajo fue apoyado por la beca NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Bioquímica coclear cromatografía LC-MS/MS espectrometría de masas Proteómica epitelio sensorial
    De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter