使用无标记光学生物传感器由G-蛋白偶联受体，以检测钾通道的调制
Summary
光学生物传感器技术可检测的变化在质量近质膜在活细胞中，并允许1到跟随在这两个单个细胞和细胞群的细胞反应。这个协议将描述检测钾通道通过使用这种方法的G蛋白偶联受体在完整的细胞调制的。
Abstract
离子通道通过选择性地允许离子流通过质膜1控制神经元和其它可兴奋细胞类型的电性能。来调节神经细胞的兴奋性，离子通道的生物物理学性质通过信号转导蛋白和分子，这常常结合到通道本身以形成异聚复合信道2,3修改。传统的分析检查通道和调节蛋白之间的相互作用需要外源性标记，可以潜在地改变蛋白质的行为和减少靶的生理相关性，同时提供的信息很少的相互作用的时间过程中的活细胞。光学生物传感器，如X-BODY Biosciences公司的BIND扫描系统，使用了一种新的无标记技术，谐振波长光栅（RWG）的光学生物传感器，以检测共振改变反射光接近传感器。该测定法允许的相对的检测活细胞粘附于从细胞粘附配体诱导的变化和扩展性，毒性，增殖，并改变蛋白质 – 蛋白质相互作用的靠近质膜产生的生物传感器表面的底部部分内的质量变化。 RWG光学生物传感器已用于以下激活G蛋白偶联受体（GPCR），受体酪氨酸激酶，与其他细胞表面受体来检测附近的细胞的细胞膜的变化质量。在离子通道蛋白相互作用的配体诱导的变化，也可以使用该测定法的研究。在本文中，我们将描述用于检测臂-乙酸钠活化的钾（K Na）的通道由G蛋白偶联受体的调节的实验步骤。
Introduction
在他们的生理有关的上下文检查活细胞关键的是要了解目标细胞的生物学功能。然而，实验研究渠道和监管细胞质蛋白，如免疫沉淀测定法之间的相互作用，通常提供的信息很少在活细胞相互作用的时间过程。大多数当前的基于细胞的测定法测定特异性细胞事件，例如感兴趣的荧光标记蛋白的易位。这些测定中所需要的感兴趣的蛋白质的修饰，这可以潜在地改变蛋白质的行为和减少靶的生理相关性。非侵入性的基于细胞的测定法，它不需要操纵系统，提供细胞活性的连续测定，并允许细胞的研究，在其最生理学相关的状态4。
光学生物传感器的设计，生产一个可测量的变化在被耦合到所述传感器表面的光的特性。光学生物传感器，利用渐逝波，其中包括表面等离子体共振（SPR）和谐振波长光栅（RWG）技术，已被主要用于检测分子结合到其固定在传感器表面上的生物受体的亲和力和动力学。最近，市售的RWG生物传感器已被开发，以使细胞附着在传感器表面上的高空间分辨率（高达3.75微米/像素）5的底部部分内的质量的相对变化的检测。这些生物传感器可以检测到附近的活细胞所导致的刺激作用，如细 胞粘附和铺展性，毒性，增殖和由多种细胞表面受体，包括G蛋白偶联受体（GPCRs）的诱发信号转导通路的质膜变化6质量。 RWG生物传感器检测的相对瓒格中折射的作为内传感器7为150nm的质量的相对变化的函数的索引。当细胞接种到生物传感器，这种变化在折射指数反映的质量变化从靠近在蜂窝粘附到所述生物传感器的变化而产生的细胞的质膜上。该协议将讨论使用RWG生物传感器通道蛋白质相互作用的检测。
RWG数据采集系统由几个部分组成。因为X-BODY Biosciences公司BIND扫描仪被用于这些实验中，我们将参照部件为这个特定的系统，它由一个平板阅读器，相关联的生物传感器，BIND扫描采集软件，和BIND查看分析软件8。光子晶体生物传感器下文提及光学生物传感器组成之一个周期性排列以电介质材料2或三个维度可防止光传播特定波长和方向。光子晶体结构是基于这种现象叫伍德的异常。首先由伍德在1902年发现，这些异常都是在光的地方在特定衍射级的强度迅速变化发生在某些窄频带光衍射光栅反射光谱观察到的效果。 1962年，和•海斯尔提出Oliner木材的异常现象的新理论在有限的时间内光栅产生一个常设的谐振波长9。在这里所描述的光学生物传感器，伍德异常被用来产生一个RWG生物传感器的，当用白光刺激仅反映非常窄的波长频带（通常介于850-855纳米）。
个体的生物传感器包括一个低折射率的塑料材料与涂有薄薄的一层高折射电介质材料的二氧化钛（TiO 2的）的周期性表面结构。当BIOSENS或者被点亮以宽广的波长的光源，光子晶体的光学光栅反射一个狭窄的范围内这是用分光光度计在BIND扫描仪测量的光的波长。反射的波长（峰值波长值，或PWV）的峰强度，然后从该信号来计算。的光的变化后，在折射率变化的PWV作为生物传感器表面附近内的增加或减少的质量（〜150纳米）的结果。光学生物传感器被纳入一个标准学会生物分子科学（SBS）384 – 孔微量培养板用于这些实验中使用的测定法。
RWV生物传感器被用于在添加外源的信号来检测活细胞中的变化10。细胞直接培养到RWG生物传感器的表面，并且在折射的本地索引的变化是在与特定的刺激治疗监测。质量变化在生物传感器的方向可以是决定的，因为增加从附近的生物传感器的质量增加验光结果和本地索引是按增加PWV。相反，在大规模的减少产生的PWV下降。在检测到的脉搏波速度的变化会导致从众多的细胞事件，包括改变细胞粘附，蛋白质招募/释放，细胞内吞作用和回收，胞吐作用，细胞凋亡和细胞骨架重排。例如，该测定可检测钾通道和其它细胞质或细胞骨架成分之间变化的信道 – 蛋白质相互作用的。的情况下，但是，必须发生在接近传感器的〜150nm的检测区域内，并在附属小区，靠近质膜的情况下。采集细胞反应进行与BIND软件扫描并生成每个384口井的SBS板的图像表示。该系统具有高达3.75微米/像素的分辨率，可检测单个细胞的活动，并既可以用于与细胞系（例如HEK293或CHO细胞），或与多种生理上相关的原代细胞。在BIND View软件图像分析允许个人和细胞群体中的细胞反应的检测。作为生物传感器结合到标准的SBS 384孔板，该系统易于适应高通量筛选（HTS）。
共振波长的光栅的光学生物传感器已使用过以下激活的GPCR 11来检测附近的细胞质膜质量变化。我们实验室已经克隆了钠激活（K Na）的钾通道，斯莱克-B和油滑12。两个臂-B和油滑通道的活性已被证明是非常强烈的直接激活蛋白激酶C（PKC）13的的影响。 Gαq蛋白偶联受体，如M1毒蕈碱受体和mGluR1的代谢型谷氨酸为r的活化eceptor，有力地通过PKC活化调节通道活性。这K个钠通道有助于神经细胞适应持续刺激期间和调节动作的定时的准确度电势14。松弛渠道已知与多种胞质信号分子，包括FMRP，脆性X智力迟钝蛋白15,16的相互作用。突变松弛导致婴儿期（MMPSI），癫痫的早期发作的形式导致严重的发育迟缓17多个迁移部分性发作。
Protocol
Representative Results
Discussion
在Z素（Z'）的因素是量化的高通量筛选测定法20的质量的普通统计方法，并且因为G蛋白偶联受体激动剂在此测定法的筛选中发生一个SBS兼容384孔分析，提供了极好的衡量这个实验21的鲁棒性和有效性。 1 A-Z'值表示理论上的理想实验与数据点与不存在的标准偏差无限多。 0.5-1之间AZ'值被认为是一个很好的检验为高通量筛选的目的，用低于0.5被认为是轻微翔实的分析。对于这…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢养养眼博士在弗雷德Sigworth博士在耶鲁大学的HEK293细胞稳定表达大鼠斯莱克-B蛋白质的慷慨捐赠实验室。此外，作者感谢Sigworth博士在视频介绍中显示松弛的低温电子显微镜同源模型。这项研究是由美国国立卫生研究院资助DH067517和NS073943到LKK支持
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
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