שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון
Summary
טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.
Abstract
תעלות יונים לשלוט בתכונות חשמליות של תאי עצב ותאים מסוגים אחרים להתרגש ידי סלקטיבי המאפשר ליונים לזרום דרך קרום הפלזמה 1. כדי לווסת את הרגישות עצבית, מאפייני biophysical של תעלות יונים שונו על ידי איתות חלבונים ומולקולות, אשר לעתים קרובות נקשרים לערוצים עצמם כדי ליצור 2,3 מורכב ערוץ heteromeric. מבחני מסורתיים בוחנים את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים רגולטורים דורשים תוויות אקסוגני שעלולים לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד, תוך מתן מעט מידע על הקורס של אינטראקציות הזמן בתאים חיים. biosensors האופטי, כגון מערכת X-BODY Biosciences BIND הסורק, השתמש בטכנולוגיה ללא תווית רומן, צורם תהודה אורך גל (RWG) biosensors האופטי, כדי לזהות שינויים בתהודה משתקף אור ליד biosensor. assay זה מאפשר זיהוי של קרוב המשפחהשינוי במסה בתוך החלק התחתון של תאי חיים חסיד אל פני שטח biosensor כתוצאה משינויי יגנד מושרה בהידבקות תא ומתפשטת, רעיל, התפשטות, ושינויים באינטראקציות בין חלבונים בקרבת קרום הפלזמה. biosensors האופטי RWG היה בשימוש כדי לזהות שינויים במסה קרובים לקרום הפלזמה של תאים לאחר הפעלה של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs), טירוזין קינאז רצפטור, וקולטני תא שטח אחר. שינויי יגנד-Induced באינטראקציות ערוץ חלבון יון גם ניתן ללמוד באמצעות assay זה. במאמר זה, נתאר את ההליך ניסיוני המשמש לגילוי האפנון של אשלגן המופעל נתרן המרווח-B ערוצים (K Na) על ידי GPCRs.
Introduction
בחינת תאי חיים בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם היא קריטית להבנת הפונקציות הביולוגיות של יעדים סלולריים. עם זאת, מבחני שבחנו את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים cytoplasmic רגולציה, כגון מבחני coimmunoprecipitation, בדרך כלל לספק מעט מידע על הקורס של אינטראקציות בתאים חיים בזמן. רוב מבחני תא מבוסס הנוכחיים למדוד אירוע תאי ספציפי, כגון טרנסלוקציה של חלבונים מתויגים fluorescently של עניין. מבחני אלו דורשים שינויים של החלבונים של עניין, אשר יכולה לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד. מבחני תא פולשנית מבוססים, אשר אינו דורשים מניפולציה של המערכת, לספק מדידה רציפה של פעילות תאית ומאפשרים מחקרים של תאים ברוב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם מדינת 4.
biosensors האופטי מתוכננים לייצרשינוי שניתן לכמת במאפיין של האור שהוא מצמידים את משטח החיישן. biosensors האופטי לנצל גלי חלוף, הכולל משטח תהודה plasmon (SPR) וצורמים גל תהודה טכניקות (RWG), היה בשימוש בעיקר כדי לזהות את הזיקות וקינטיקה של מולקולות נקשרות לרצפטורים הביולוגיים שלהם משותקים על משטח החיישן. לאחרונה, biosensors RWG זמין מסחרי פותחו על מנת לאפשר זיהוי של השינוי היחסי במסה בתוך החלק התחתון של תאים חסיד אל פני השטח החיישן ברזולוציה מרחבית גבוהה (עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל) 5. biosensors אלה יכולים לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאי חיים הנובעים מגירוי, כגון הידבקות תא ומתפשט, רעיל, התפשטות ומסלולי איתות שהושרו על ידי מגוון רחב של קולטני תא שטח כוללים קולטנים בשילוב ה-G-חלבון (GPCRs) 6 . biosensors RWG לזהות chan היחסיge במדד השבירה כפונקציה של השינוי היחסי במסה בתוך 150 ננומטר של biosensor 7. כאשר תאים מצופה לbiosensor, שינוי זה באינדקס שבירה משקף את השינוי במסה ליד קרום הפלזמה של התא כתוצאה משינוי בדבקות סלולרית לbiosensor. פרוטוקול זה יעסוק בזיהוי של אינטראקציות ערוץ חלבון באמצעות biosensors RWG.
מערכות רכישת נתונים RWG מורכבות ממספר מרכיבים. בגלל X-BODY Biosciences BIND הסורק שימש לניסויים אלה, נתייחס לרכיבים למערכת המסוימת הזה, אשר מורכב מקורא צלחת, biosensors קשור, תוכנת רכישת BIND סריקה, ותוכנת צפייה בBIND ניתוח 8. Biosensors הגבישים פוטוניים, המכונה להלן biosensors אופטי כ, מורכבים מסידור תקופתי של דיאלקטרי ומהותי ב2 או 3 ממדים אשר מונע את התפשטות אור בספציפיאורכי גל וכיוונים. מבני גבישים פוטוניים מבוססים על תופעה שנקראת האנומליה של ווד. התגלו לראשונה על ידי עץ ב1902, אנומליות אלה הן תופעות שנצפו בספקטרום של אור מוחזר על ידי שבכות שבירה אופטיות שבו וריאציות מהירים בעוצמת הזמנות עקיפה מסוימות מתרחשות בתדרים צרים מסוימים. ב1962, Hessel וOliner הציגו תאוריה חדשה של החריגות של עץ שבו צורם תקופה מוגבלת יוצרת גל תהודה עומד 9. בbiosensors האופטי שתואר כאן, חריגות של עץ משמשות לייצור biosensor RWG שכאשר מגורה עם אור לבן משקף את הלהקה רק צרה מאוד של אורכי גל (בדרך כלל בין 850-855 ננומטר).
biosensors פרט מורכב של חומר פלסטי מדד נמוך שבירה עם משטח מבנה מחזורי אשר מצופה בשכבה דקה של תחמוצת גבוהה שבירת דיאלקטרי טיטניום חומר (Tio 2). כאשר Biosensאו מואר עם רחב מקור אור באורך גל, הצורם האופטית של גבישים פוטוניים משקף טווח צר של אורכי גל של אור הנמדד על ידי ספקטרופוטומטר בסורק BIND. עוצמת השיא של אורכי הגל משתקף (שיא גל הערך, או PWV) מחושבת אז מהאות. PWV של משמרות אור על שינוי במדד השבירה כתוצאה מעלייה או ירידה במסה בתוך הקרבה (~ 150 ננומטר) של פני השטח biosensor. biosensors האופטי משולבים האגודה סטנדרטית למדעי Biomolecular (SBS) microplate 384 גם למבחנים המשמשים בניסויים אלה.
biosensors RWV משמשים לאיתור שינויים על תוספת של אותות אקסוגניים בתאים חיים 10. תאים בתרבית ישירות על גבי המשטח של biosensor RWG והשינוי במדד המקומי של שבירה הוא פיקוח על טיפול בגירויים ספציפיים. הכיוון של שינוי במסה בbiosensor יכול להיותנקבע, כי עלייה במדד המקומי של תוצאות שבירה מעלייה במסה ליד biosensor ונמדדת כגידול בPWV. לעומת זאת ירידה במסה מייצרת ירידת PWV. השינוי בPWV המזוהה יכול לנבוע מאירועים סלולריים רבים, בם שינויים בהידבקות תא, גיוס / שחרור חלבון, אנדוציטוזה ומחזור, exocytosis, אפופטוזיס, וסידור מחדש cytoskeletal. לדוגמא, assay ניתן לזהות שינויים באינטראקציות ערוץ חלבון בין תעלות אשלגן ורכיבי cytoplasmic או cytoskeletal אחרים. האירוע, לעומת זאת, חייב להתרחש בתוך אזור זיהוי ננומטר ~ 150 ליד biosensor, ובמקרה של תא מצורף, ליד קרום הפלזמה. רכישה של תגובות הסלולר מתבצעת עם תוכנת BIND Scan וייצוג דמותו של כל אחד מ384 הבארות בצלחת SBS הוא שנוצר. במערכת זו יש רזולוציה של עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל, המאפשר זיהוי של אירועים בתאים בודדים, וניתן להשתמש בו גם עם שורות תאים (כגון תאי HEK293 או CHO) או עם יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תאים ראשוניים. ניתוח תמונה עם צפייה BIND תוכנה מאפשר זיהוי של תגובות תאיות בשני בודד ואוכלוסיות של תאים. כbiosensors ישולבו SBS הסטנדרטי 384 גם microplates, המערכת היא בקלות להתאמה לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS).
biosensors האופטי סבכת תהודה הגל בעבר נעשה שימוש כדי לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאים הבאים הפעלה של 11 GPCRs. המעבדה שלנו משובט שני ערוצים (K Na) מופעל נתרן, אשלגן, מרווח-B ו12 סליק. פעילותם של שני ערוצי המרווח-B וסליק הוכח להיות מאוד מושפע במידה רבה על ידי הפעלה ישירה של חלבון קינאז C (PKC) 13. הפעלה של רצפטורים חלבון q Gα בשילוב, כגון קולט מוסקריניים M1 ו r גלוטמט metabotropic mGluR1eceptor, בעצמה מסדיר את פעילות ערוץ באמצעות הפעלת PKC. ערוצי K נה אלה תורמים להסתגלות עצבית בזמן גירוי מתמשך ולהסדיר את הדיוק של תזמון של פעולת פוטנציאלי 14. ערוצים רפויים ידועים אינטראקציה עם מגוון רחב של מולקולות איתות cytoplasmic, כוללים FMRP, חלבון X פיגור שהכלי השביר 15,16. מוטציות בתוצאת מרווח בהתקפים חלקיים מעבר מרובים של ינקות (MMPSI), צורת התחלה מוקדמת של אפילפסיה שתוצאתה עיכוב התפתחותי חמור 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
ראש Z (Z ') הגורם הוא שיטה סטטיסטית מקובלת לכמת את האיכות של assay הקרנת תפוקה גבוהה 20, וכי ההקרנה של אגוניסטים GPCR בassay זה התרחשה בassay 384 גם תואם SBS, מספק מצוין מידה של החוסן ותוקפו של assay זה 21. הערך 'AZ של 1 מציין assay תיאורטי אידיאלי עם מספר אינסופי של נקודות נתוני…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד"ר Yangyang יאן במעבדה של ד"ר פרד Sigworth באוניברסיטת ייל לתרומתו הנדיבה של HEK293 תאים ביציבות להביע מרווח-B חלבון חולדה. בנוסף המחברים מודים לד"ר Sigworth עבור דגם ההומולוגיה מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-של המרווח מוצג במבוא הווידאו. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקי DH067517 וNS073943 לLKK
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
