Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren
Summary
Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.
Abstract
Ion kanalen van de elektrische eigenschappen van neuronen en andere exciteerbare celtypes selectief toestaan ionen stromen door het plasmamembraan 1. Neuronale exciteerbaarheid reguleren, worden de biofysische eigenschappen van ionenkanalen gemodificeerd door signalerende proteïnen en moleculen, die vaak binden aan de kanalen zelf een heteromere kanaalcomplex 2,3 vormen. Traditionele assays onderzoeken van de interactie tussen kanalen en regulerende proteïnen vereisen exogene labels die mogelijk kunnen veranderen gedrag van de proteïne en de fysiologische relevantie van het doel af, terwijl weinig gegevens over het tijdsverloop van interacties in levende cellen. Optische biosensoren, zoals de X-BODY Biosciences BIND Scanner systeem, gebruik maken van een nieuw label-free technologie, resonantiegolflengte raspen (RWG) optische biosensoren, om veranderingen te detecteren in resonante gereflecteerde licht in de buurt van de biosensor. Deze test maakt de detectie van de relatieveverandering in massa in het onderste gedeelte van levende cellen aanhanger van de biosensor oppervlak verkregen door ligand geïnduceerde veranderingen in celhechting en spreiding, toxiciteit, proliferatie, en veranderingen in eiwit-eiwit interacties bij de plasmamembraan. RWG optische biosensoren zijn gebruikt om veranderingen in de massa nabij de plasmamembraan van cellen te detecteren na activatie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), receptor tyrosine kinases en andere celoppervlak receptoren. Ligand-geïnduceerde veranderingen van ionkanaal-eiwit interacties kunnen worden onderzocht door deze test. In dit artikel zullen we de experimentele procedure die wordt gebruikt om de modulatie van Slack-B-natrium geactiveerd kalium (K Na) kanalen door GPCR's detecteren beschrijven.
Introduction
Onderzoeken levende cellen in hun fysiologisch relevante context is cruciaal voor het begrijpen van de biologische functies van cellulaire doelwitten. Echter, assays onderzocht de interactie tussen kanalen en regulerende cytoplasmatische eiwitten, zoals co-immunoprecipitatie assays algemeen weinig informatie over het tijdsverloop van interacties in levende cellen. De meerderheid van de huidige cel-gebaseerde testen meten een specifieke cellulaire gebeurtenis, zoals de translocatie van een fluorescent gelabeld eiwit van belang. Deze testen vereisen modificaties van de eiwitten van belang, die mogelijk kan veranderen gedrag van de proteïne en de fysiologische relevantie van het doel verminderen. Invasieve cel-gebaseerde testen, die geen manipulatie van het systeem vereisen, vormen een continue meting van cellulaire activiteit en maken studies van cellen in hun meest fysiologisch relevante stand 4.
Optische biosensoren kunnen een ruimteeen meetbare verandering in een eigenschap van het licht dat is gekoppeld aan het sensoroppervlak. Optische biosensoren die verdwijnende golven gebruiken, welk oppervlak plasmon resonantie (SPR) en resonantiegolflengte rooster (RWG) technieken omvatten, zijn voornamelijk gebruikt om de affiniteit en kinetiek van moleculen binden aan hun biologische receptoren geïmmobiliseerd op het sensoroppervlak detecteren. Recenter zijn commercieel verkrijgbaar RWG biosensoren ontwikkeld voor de detectie van de relatieve verandering in massa in het onderste gedeelte van de cellen aanhanger van het sensoroppervlak met hoge ruimtelijke resolutie (tot 3,75 micrometer / pixel) 5 mogelijk. Deze biosensoren kunnen veranderingen in de massa sporen nabij het plasmamembraan van levende cellen als gevolg van stimulatie, zoals celadhesie en spreiding, toxiciteit, proliferatie en signaalwegen opgewekt door verschillende celoppervlak receptoren zoals G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) 6 . RWG biosensoren detecteren de relatieve change in de brekingsindex als functie van de relatieve verandering in massa binnen 150 nm van de biosensor 7. Wanneer cellen worden uitgeplaat op de biosensor, deze verandering in de brekingsindex weerspiegelt de verandering in massa nabij de plasmamembraan van de cel als gevolg van een verandering in cellulaire hechting aan de biosensor. Dit protocol zal de detectie van kanaal-eiwit interacties met behulp van RWG biosensoren te bespreken.
RWG data acquisitie systemen bestaan uit verschillende componenten. Omdat de X-BODY Biosciences BIND Scanner werd gebruikt voor deze experimenten, zullen we verwijzen naar de onderdelen van dit systeem, dat bestaat uit een plaatlezer, verbonden biosensoren, BIND Scan acquisitie software en BIND weergeven analysesoftware 8. De fotonische kristallen biosensoren, aangeduid als optische biosensoren hierna, bestaan uit een periodieke rangschikking van een diëlektrisch materiaal en in 2 of 3 dimensies die de voortplanting van licht voorkomt op specifiekegolflengten en een routebeschrijving. Fotonisch kristal gebaseerd worden op een fenomeen genaamd Wood anomalie. Eerst ontdekt in 1902 door Wood, deze afwijkingen zijn waargenomen in het spectrum van het licht gereflecteerd door de optische buigingsroosters waar snelle fluctuaties in de intensiteit van bepaalde diffraktie-ordes ontstaan in bepaalde smalle frequentiebanden. In 1962, Hessel en Oliner presenteerde een nieuwe theorie van Wood's afwijkingen waarin eindige periode rooster genereert een staande resonantiegolflengte 9. In de optische biosensoren hier beschreven, worden Wood anomalieën gebruikt om een RWG biosensor produceren dat wanneer gestimuleerd met wit licht reflecteert slechts zeer smalle band van golflengten (meestal tussen 850-855 nm).
Individuele biosensoren bestaan uit een lage-brekingsindex kunststof met een periodieke oppervlaktestructuur die is bekleed met een dunne laag van hoge brekingsindex diëlektrisch materiaal titaniumdioxide (TiO2). Wanneer de Biosensof verlicht met een brede golflengte lichtbron, het optische raster van fotonische kristallen weerspiegelt een smal bereik van golflengten van licht die wordt gemeten met een spectrofotometer in het BIND scanner. De piekintensiteit van de gereflecteerde golflengten (Piekgolflengte waarde of PWV) wordt dan berekend uit het signaal. De PWV licht verschuift op een verandering in de brekingsindex tengevolge van een toename of afname in massa in de nabijheid (~ 150 nm) van de biosensor oppervlak. Optische biosensoren worden opgenomen in een standaard Society for Biomolecular Sciences (SBS) 384 microplaat voor de testen die in deze experimenten.
RWV biosensoren worden gebruikt om veranderingen te detecteren na toevoeging van exogene signalen in levende cellen 10. Cellen worden gekweekt direct op het oppervlak van een biosensor RWG en de verandering in de plaatselijke brekingsindex wordt gecontroleerd bij behandeling met specifieke stimuli. De richting van de verandering in belasting van het biosensor kanbepaald, omdat een toename van de plaatselijke brekingsindex gevolg van een toename van de massa nabij de biosensor en wordt gemeten als een toename van PWV. Daarentegen een afname in massa wordt verlaging van PWV. De verandering in gedetecteerd PWV kunnen voortvloeien uit tal van cellulaire gebeurtenissen, met inbegrip van veranderingen in cel adhesie, eiwit werving / release, endocytose en recycling, exocytose, apoptose, en het cytoskelet omlegging. Bijvoorbeeld, kan de test worden gedetecteerd veranderingen in kanaal-eiwitinteracties tussen kaliumkanalen en andere cytoplasmatische of cytoskelet componenten. De gebeurtenis moet echter plaatsvinden binnen de ~ 150 nm detectiezone nabij de biosensor, en bij een aangesloten cel, bij plasmamembraan. Verwerving van cellulaire reacties wordt uitgevoerd met BIND software scannen en een beeldweergave van elk van de 384 putjes in de plaat SBS gegenereerd. Dit systeem heeft een resolutie van 3,75 um / pixel, waardoor detectie van gebeurtenissen in enkele cellen enkan worden gebruikt met cellijnen (zoals HEK293-of CHO-cellen) of meer fysiologisch relevante primaire cellen. Beeldanalyse met BIND View software maakt het mogelijk de detectie van cellulaire reacties in zowel individuele als populaties van cellen. Als biosensoren 384 putjes opgenomen in standaard microtiterplaten SBS, het systeem gemakkelijk kan worden aangepast aan high-throughput screening (HTS).
Resonantie-golflengte raster optische biosensoren zijn eerder gebruikt om veranderingen in de massa nabij de plasmamembraan van cellen te detecteren na activering van GPCR 11. Ons laboratorium heeft gekloond twee-natrium geactiveerd (K Na) kalium kanalen, Slack-B Slick 12. De activiteit van zowel slappe B Gladde kanalen is aangetoond dat het zeer sterk beïnvloed door directe activatie van proteïne kinase C (PKC) 13 zijn. Activering van q Ga-proteïne gekoppelde receptoren, zoals de muscarine M1 receptor en mGluR1 metabotrope glutamaat receptor, krachtig regelt kanaal activiteit door middel van PKC activering. Deze K Na kanalen bijdragen aan neuronale aanpassing tijdens langdurige stimulatie en reguleren van de nauwkeurigheid van de timing van actiepotentialen 14. Slack kanalen zijn bekend om te interageren met een verscheidenheid aan cytoplasmatische signaalmoleculen, waaronder FMRP, het Fragiele X mentale retardatie eiwit 15,16. Mutaties in Slack resultaat in meerdere Migreren partiële aanvallen van Kindertijd (MMPSI), een vroeg begin vorm van epilepsie die leidt tot ernstige vertraging in de ontwikkeling 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
De prime Z (Z ') factor een gemeenschappelijke statistische methode om de kwaliteit van een high-throughput screening assay 20 kwantificeren, en omdat de screening van de GPCR agonisten in deze test vond plaats in een SBS compatibele 384-well assay, een uitstekende maat voor de robuustheid en de geldigheid van deze test 21. AZ 'waarde 1 geeft een theoretisch ideaal assay met een oneindig aantal gegevenspunten met onbestaande standaardafwijkingen. AZ 'waarde tussen 0,5-1 wordt beschouwd …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dank aan Dr Yangyang Yan in het laboratorium van Dr Fred Sigworth aan de Yale University voor de gulle donatie van HEK293 cellen die stabiel tot expressie rat Slack-B-eiwit. Daarnaast zijn de auteurs zijn dank aan Dr Sigworth voor cryo-elektronenmicroscopie homologiemodel van Slack getoond in de video-introductie. Dit onderzoek werd ondersteund door NIH Grants DH067517 en NS073943 te LKK
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
