O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Summary

Técnicas de biossensor ópticos podem detectar alterações na massa perto da membrana plasmática em células vivas e permite que se siga as respostas celulares em ambas as células individuais e as populações de células. Este protocolo descreve a detecção da modulação de canais de potássio de L-receptores acoplados à proteína em células intactas utilizando este método.

Abstract

Canais iônicos controlar as propriedades elétricas dos neurônios e outros tipos de células excitáveis, permitindo seletivamente íons a fluir através da membrana plasmática ^1. Para regular a excitabilidade neuronal, as propriedades biofísicas de canais de iões são modificadas por proteínas e moléculas de sinalização, o que muitas vezes se ligam aos próprios canais de modo a formar um complexo do canal heteromérico de ^2,3. Ensaios tradicionais que examinam a interacção entre os canais e as proteínas reguladoras requerem rótulos exógenos que podem potencialmente alterar o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo, enquanto proporciona pouca informação sobre o curso de tempo de interacções em células vivas. Biossensores ópticos, como o sistema X-CORPO Biociências BIND Scanner, usar uma tecnologia sem rótulo novela, ressonância comprimento de onda grade (GRT) biossensores ópticos, para detectar mudanças na luz refletida ressonante perto do biossensor. Este ensaio permite a detecção da relativaalterar em massa no interior da porção inferior das células vivas aderentes à superfície do biossensor, resultante do ligando alterações induzidas na adesão celular e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação, e as alterações nas interacções proteína-proteína, perto da membrana do plasma. RWG biossensores ópticas têm sido utilizadas para detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a activação de receptores acoplados à proteína (GPCRs), tirosina-quinases receptoras, e os outros receptores da superfície celular. As alterações induzidas pelo ligando de iões de interacções proteína-canal também pode ser estudada utilizando este ensaio. Neste artigo, vamos descrever o procedimento experimental usado para detectar a modulação da Slack-B potássio ativado por sódio _(Na) K canais por GPCRs.

Introduction

Examinando as células vivas em seu contexto fisiologicamente relevante é crucial para entender as funções biológicas de alvos celulares. No entanto, os ensaios que examinam a interacção entre os canais e as proteínas citoplasmáticas de regulação, tais como ensaios de coimmunoprecipitation, geralmente fornecem pouca informação sobre o curso de tempo de interacções de células vivas. A maioria dos ensaios com base em células de corrente mede um evento celular específico, tal como a translocação de uma proteína de interesse fluorescente etiquetado. Estes ensaios requerem modificações das proteínas de interesse, o que pode, potencialmente, alteram o comportamento da proteína e diminuem a relevância fisiológica do alvo. Ensaios baseados em células não-invasiva, que não requerem a manipulação do sistema, proporcionam uma medição contínua da actividade celular e permitem estudos de células na sua mais fisiologicamente relevante estado ^4.

Biossensores ópticos são projetados para produziruma mudança mensurável em uma característica da luz, que é acoplada à superfície do sensor. Biossensores ópticos, que utilizam ondas evanescentes, que incluem ressonância de plasma de superfície (SPR) e comprimento de onda de ressonância grade () RWG técnicas, têm sido utilizados principalmente para detectar as afinidades e cinéticas de moléculas de ligação aos seus receptores biológicos imobilizadas na superfície do sensor. Mais recentemente, biossensores RWG comercialmente disponíveis foram desenvolvidas para permitir a detecção da mudança relativa da massa dentro da porção inferior de células aderentes à superfície do sensor em alta resolução espacial (até 3,75 mM / pixel) ^5. Estes biossensores podem detectar as alterações na massa perto da membrana plasmática de células vivas que resultam da estimulação, tal como a adesão de células e de espalhamento, a toxicidade, a proliferação e as vias de sinalização induzidas por uma variedade de receptores de superfície celular, incluindo a proteína G Os receptores acoplados (GPCRs) ⁶ . Biossensores RWG detectar a relação change no índice de refracção como uma função da alteração relativa na massa a cerca de 150 nm do biossensor ^7. Quando as células são plaqueadas para o biossensor, esta alteração no índice de refracção reflecte a variação da massa perto da membrana plasmática da célula, resultante de uma mudança na adesão celular para o biossensor. Este protocolo irá discutir a detecção de interações proteína-canal utilizando biossensores RWG.

Sistemas de aquisição de dados RWG composto de vários componentes. Porque o X-CORPO Biociências BIND Scanner foi utilizada para estes experimentos, nos referiremos aos componentes para este sistema especial, que consiste em um leitor de placas, biossensores associados, software de aquisição de BIND Digitalizar e software BIND Ver análise ^8. Os biossensores cristal fotónicas, referido daqui em diante como biossensores ópticos, são compostos de um arranjo periódico de um dieléctrico e o material em duas ou três dimensões, que impede a propagação da luz no específicacomprimentos de onda e as direcções. Estruturas de cristal fotônico são baseados em um fenômeno chamado de anomalia de Wood. Descoberto pela primeira vez por Wood em 1902, estas anomalias são efeitos observados no espectro de luz refletida por redes de difração óptica onde as variações bruscas de intensidade de determinadas ordens de difração ocorrem em determinadas faixas de freqüências estreitas. Em 1962, Hessel e Oliner apresentaram uma nova teoria de anomalias de madeira em que período finito grade gera um comprimento de onda de ressonância de pé ^9. Nos biossensores ópticos descritos aqui, anomalias de madeira são utilizados para produzir um biossensor RWG que, quando estimuladas com luz branca reflecte apenas a banda estreita de comprimentos de onda (tipicamente entre 850-855 nm).

Biossensores individuais consistem de um material plástico de baixo índice de refracção, com uma estrutura de superfície periódica que é revestida com uma fina camada do material de dióxido de titânio dieléctrica de refracção elevado (TiO _2). Quando os biosensou é iluminada com uma fonte de luz de comprimento de onda larga, a grade óptica de cristais fotónicas reflecte uma estreita gama de comprimentos de onda da luz que é medida por um espectrofotómetro no scanner BIND. O pico de intensidade dos comprimentos de onda reflectidos (Comprimento de onda de pico do valor, ou PWV) é então calculado a partir do sinal. O VOP de luz muda sobre uma alteração no índice de refracção, como resultado de um aumento ou diminuição da massa dentro da proximidade (~ 150 nm) da superfície do biossensor. Biossensores ópticos são incorporados numa Sociedade padrão de Ciências Biomolecular (SBS) de 384 poços de microplacas para os ensaios utilizados nestas experiências.

Biossensores RWV são usadas para detectar alterações com a adição de sinais exógenos em células vivas ^10. As células são cultivadas directamente sobre a superfície de um biossensor RWG e a mudança no índice de refracção do local é monitorado por meio de tratamento com estímulos específicos. A direção da mudança em massa no biosensor pode serdeterminada, porque o aumento do índice de refracção locais de resultados de um aumento da massa próximo do biossensor e é medido como um aumento na VOP. Inversamente, uma redução na massa produz uma diminuição na VOP. A mudança na VOP detectado pode ser resultado de vários eventos celulares, incluindo mudanças na adesão celular, proteínas de recrutamento / release, endocitose e reciclagem, exocitose, apoptose e do citoesqueleto rearranjo. Por exemplo, o ensaio pode ser detectar alterações em interacções proteína-canais entre os canais de potássio e outros componentes citoplasmáticos ou do citoesqueleto. O caso, no entanto, deve ocorrer dentro da zona de detecção nm ~ 150 perto do biossensor, e, no caso de uma célula em anexo, perto da membrana do plasma. Aquisição de respostas celulares é realizada com software BIND Scan e uma representação da imagem de cada um dos 384 poços na placa de SBS é gerado. Este sistema tem uma resolução de até 3,75 mM / pixel, permitindo a detecção de eventos em células isoladas, epode ser utilizado, quer com linhas celulares (tais como células CHO ou HEK293) ou com mais fisiologicamente relevante células primárias. A análise de imagem com o BIND Ver software permite a detecção de respostas celulares, tanto individual e as populações de células. Como os biosensores são incorporados padrão SBS microplacas de 384 poços, o sistema é facilmente adaptável para rastreio de alto rendimento (HTS).

Ressonância comprimentos de onda ópticos ralar biossensores foram previamente usados ​​para detectar alterações na massa perto da membrana plasmática das células após a ativação de GPCRs ^11. O nosso laboratório clonou dois canais de potássio (K _Na) ativado em sódio, Slack-B e Slick ^12. A actividade de ambos os canais Slack-B e liso tem sido demonstrado ser muito fortemente influenciados pela activação directa de proteína quinase C (PKC) ^13. A activação dos receptores acoplados à proteína _q Gu, tais como o receptor muscarínico M1 e o mGluR1 metabotrópicos de glutamato receptor, potente regula a atividade do canal por meio da ativação da PKC. Estes canais de K _{de Na} contribuir para a adaptação neuronal durante a estimulação prolongada e regular a precisão de tempo de potenciais de ação ^14. Slack canais são conhecidos por interagir com uma variedade de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas, incluindo FMRP, a proteína X frágil Mental Retardation ^15,16. Mutações no resultado Slack em vários Migrando crises parciais de Infância (MMPSI), uma forma de início precoce da epilepsia o que resulta em atraso grave de desenvolvimento ^17.

Protocol

1. Cultura de Células (Adaptado de Fleming e Kaczmarek 18) Células de cultura em mídia apropriada para maior do que 2, mas menos de 10 passagens antes do uso neste ensaio. Não transfectadas células HEK-293 e células HEK-293 expressando estavelmente a proteína de rato Slack-B foram cultivadas em meio de Eagle uma metade de Dulbecco Modificado e metade meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado calor e antibióticos. 500 ug / ml de geneticina (G418) é adiciona…

Representative Results

Slack-B transfectadas estavelmente células HEK-293 transfectadas e controlam as células HEK-293 foram semeadas a 1000 células / poço em 384 bem-ECM, placas revestidas com biossensores RWG. Imagens da central de 1,5 milímetros 2 do biossensor foram gravadas com uma resolução de 3,75 mM / pixel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidade de massa foram gerados antes e 30 minutos após adição composto com o software BIND Scan. O BIND Ver software foi utilizado para determinar a mudança…

Discussion

O principal Z (Z ') é um factor de método estatístico comum para quantificar a qualidade de um ensaio de rastreio de alto rendimento ^{de 20,} e porque o rastreio de agonistas de GPCR neste ensaio ocorreram numa compatível ensaio de 384 cavidades SBS, proporciona uma excelente medida da robustez e validade deste ensaio ^21. Valor AZ 'de 1 indica um ensaio teoricamente ideal, com um número infinito de pontos de dados com desvios padrão inexistentes. Valor AZ 'entre 0,5-1 é considerado…

Materials

DMEM, High Glucose	Life Technologies	11965-092
Leibovitz's L-15 Medium	Life Technologies	11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Geneticin G-418 Sulfate	American Bioanalytical	AB05057
HBSS	Life Technologies	14025-092
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Albumin from chicken egg white	Sigma-Aldrich	A5378
DPBS	Life Technologies	14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-6
Carbamoylcholine chloride	Sigma-Aldrich	C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt	Sigma-Aldrich	S8701
Finnpipette (5-50 µl)	Thermo Scientific	4662090
BIND Scanner System	X-BODY Biosciences	N/A
384-well TiO2 coated plates	X-BODY Biosciences	TiO-96-CM