L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

Résumé

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

Résumé

Les canaux ioniques contrôler les propriétés électriques des neurones et d'autres types de cellules pouvant être excitées sélectivement par des ions permettant de couler à travers la membrane plasmique ^1. Pour réguler l'excitabilité neuronale, les propriétés biophysiques des canaux ioniques sont modifiées par les protéines et molécules de signalisation, qui se lient souvent les chaînes elles-mêmes pour former un complexe hétéromère de canal ^2,3. Des dosages traditionnels examinant l'interaction entre les canaux et les protéines régulatrices exogènes exigent des étiquettes qui peuvent éventuellement modifier le comportement de la protéine et de diminuer l'importance physiologique de la cible, tout en fournissant peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. Des biocapteurs optiques, tels que le système X-CORPS Biosciences BIND Scanner, utilisent une technologie sans étiquette roman, résonance longueur d'onde de réseau (GTR) de biocapteurs optiques pour détecter les changements dans la lumière réfléchie de résonance près du biocapteur. Cet essai permet la détection de l'importance relativechanger dans la masse à l'intérieur de la partie inférieure des cellules vivantes adhérentes à la surface du biocapteur résultant de ligands changements induits dans l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération, et les changements dans les interactions protéine-protéine à proximité de la membrane plasmique. Biocapteurs optiques GTR ont été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), les tyrosine kinases de récepteur, et d'autres récepteurs de la surface cellulaire. Les changements induits dans les interactions ligand-protéine canal ionique peuvent également être étudiés dans cet essai. Dans cet article, nous allons décrire la procédure expérimentale utilisée pour détecter la modulation de la Slack-B potassium activée au sodium _(Na) K canaux par les RCPG.

Introduction

D'examen des cellules vivantes dans leur contexte physiologiquement pertinent est essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des cibles cellulaires. Cependant, des dosages examinant l'interaction entre les canaux et les protéines cytoplasmiques de régulation, tels que des essais de co-immunoprécipitation, fournissent généralement peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. La majorité des essais à base de cellules en cours de mesurer un événement cellulaire spécifique, tel que la translocation d'une protéine d'intérêt marqué de manière fluorescente. Ces tests nécessitent des modificat....

Protocole

Une. Culture cellulaire (Adapté de Fleming et Kaczmarek ¹⁸⁾

1. cellules de la culture dans les médias appropriés pour plus de 2 mais moins de 10 passages avant de l'utiliser dans cet essai. Non transfectées cellules HEK-293 et ​​des cellules HEK-293 exprimant de manière stable rat protéine Slack-B sont cultivés dans du milieu d'une moitié de Dulbecco Modified Eagle et une moitié milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau foetal et des antibiotiques. 500 pg / ml de généticine (G418) est ajouté à des cellules HEK-293 exprimant de manière stable Slack-B pour sélectionner pour l'expression du canal ....

Résultats

Slack-B transfectées de façon stable cellules HEK-293 et ​​le contrôle non transfectées cellules HEK-293 ont été ensemencées à 1000 cellules / puits sur 384 et, ECM revêtu GTR plaques de biocapteurs. Images de la centrale de 1,5 mm ² du biocapteur ont été enregistrées à une résolution de 3,75 um / pixel (Figure 1). gradient de densité de masse des cartes ont été générées avant et 30 minutes après l'addition de composé avec le logiciel BIND Scan. La BIND Voir logiciel a été utilisé pour dé.......

Discussion

Le premier de Z (Z ') de facteur est une méthode statistique commun pour quantifier la qualité d'un dépistage dosage à haut débit ^20, et parce que le dépistage des agonistes de RCPG dans cet essai a eu lieu dans un essai de 384 puits compatible SBS, fournit une excellente mesure de la robustesse et de la validité de ce test ^21. AZ "valeur 1 indique une analyse théoriquement idéale avec un nombre infini de points de données avec des écarts types inexistants. AZ "valeur comprise ent.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM, High Glucose	Life Technologies	11965-092
Leibovitz’s L-15 Medium	Life Technologies	11415-064
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Geneticin G-418 Sulfate	Bioanalytique américain	AB05057
HBSS	Life Technologies	14025-092
Fibronectine du plasma humain	Sigma-Aldrich	F0895
Albumine du blanc d’œuf de poule	Sigma-Aldrich	A5378
DPBS	Life Technologies	14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-6
Chlorure de carbamoylcholine	Sigma-Aldrich	C4382
SFLLR-NH2 sel de trifluoroacétate	Sigma-Aldrich	S8701
Finnpipette (5-50 µ ; l)	Thermo Scientific	4662090
BIND Scanner System	X-BODY Biosciences	N/A
384-well TiO2 plaques revêtues	X-BODY Biosciences	TiO-96-CM