Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een ​​alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.

Introduction

Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven ^1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling ^1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale stadia, overleef de massale histolysis van de vroege stadia popstadium en uiteindelijk leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die binnen de volwassen vliegen ^1-14. Tijdens de ontwikkeling van de larven elke schijf maakt een aantal belangrijke beslissingen met betrekking tot het lot, vorm en grootte. Binnen de eerste en tweede larvale stadia, worden de schijven belast met de vaststelling van een primaire lot, establishing compartiment grenzen, de vaststelling van de juiste vorm en het genereren van de benodigde aantal cellen ^15-16. Tijdens het derde larvale instar en vroege pre-popstadium, de imaginaire schijven blijven delen en zijn patroon als cellen hun terminal lot ¹⁶ vast te stellen.

Tijdens de vroege geschiedenis van Drosophila ontwikkelingsbiologie, werden imaginal schijven vrijwel uitsluitend onderzocht in het kader van de normale ontwikkeling en in de beperkte gevallen waarin een verlies of winst-of-function mutant levensvatbaar was. Het gebruik van X-stralen induceren mitotische recombinatie toegestaan ​​letale mutaties in celklonen binnen de larven en volwassen weefsels te analyseren. Deze werkwijze is verbeterd door de introductie van transgene methoden verlies analyseren en gain-of-function mutaties in zowel larven en volwassen weefsels. Het aantal antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit vallen voor het beschrijven van de moleculaire landschap van wild-type en mutante weefsels is ook constantly groeien. Met deze moleculaire merkers verlies analyseren en gain-of-function mutante celklonen is het steeds mogelijk om een ​​real-time begrijpen hoe mutantcellen afwijken van hun wildtype neven tijdens ontwikkeling krijgen. Om goed gebruik maken van deze instrumenten en reagentia is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit van de voorbereidingen imaginal schijven die kunnen worden bekeken, gefotografeerd en geanalyseerd hebben. Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en de voorbereiding van de eye-antennaal schijf complex (Figuur 1A) te verstrekken. Het kan ook met succes worden gebruikt om een groot aantal extra schijven zoals die welke tot de vleugels, halters, T1-T3 benen en genitaliën (Figuur 1B-E) te isoleren. Deze procedure, met kleine aanpassingen is gebruikt om imaginal discs isoleren van Drosophila bijna tachtig jaren.

Zoals hierboven beschreven, aangezien de meeste genen die tijdens multiple ontwikkelingsstadia en in een veelheid van weefsels, is het vaak onmogelijk om de effecten te onderzoeken die null-mutanten op het hele oog als het dier sterft ruim voor het derde instar larvale stadium. Vier methoden hebben de studie van de meer ontwikkelde weefsels gemaakt, zoals het netvlies significant meer handelbaar. De eerste is de methode flippase (FLP) / flippase Recombinatie Target (FRT) genereren mutante cel klonen in een overigens wildtype weefsel ^17-19. In dit geval de mutant weefsel wordt geïdentificeerd door de afwezigheid van een markering zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en kan worden vergeleken met de omringende wildtype weefsel waarin GFP aanwezig is (figuur 2D). De tweede is de "FLP-out" werkwijze waarbij een transgen tot expressie wordt gebracht in een populatie van cellen ^20. In dit geval de cel klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP reporter mist (figuur2E). De derde is de Mosaic-analyse met een onderdrukbare Cell Marker (MARCM) techniek, die elementen van de FLP / FRT mutant kloon en FLP-out expressie systemen ²¹ combineert. Met deze methode een transgen kan worden uitgedrukt in een populatie van cellen die tegelijkertijd mutant voor individuele genetische locus. Like flp-out klonen worden MARCM klonen geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP merker (figuur 2F) mist. Tenslotte, de genen en RNAi constructen kunnen worden die binnen imaginaire weefsels onder controle van promotor-GAL4 constructen. Deze vier methoden hebben de belangstelling voor het bestuderen denkbeeldige schijven toegenomen sinds mutant en overexpressie klonen of direct kunnen worden vergeleken met aangrenzende wildtype weefsel. Werkwijze in deze procedure wordt beschreven is ontwikkeld om onderzoekers die de post-embryonale ontwikkeling van volwassen weefsels in Drosophila bestuderenname afkomstig uit de oog-antennaal disc, kunnen hoge kwaliteit weefsel te verkrijgen voor analyse. Hoewel individuele onderzoekers lichte wijzigingen hebben gemaakt, heeft de kern van deze procedure (die we hier beschrijven) grotendeels onveranderd gebleven. Na het behalen van hoge kwaliteit weefsel is van cruciaal belang voor de studie van de imaginaire schijven we hopen dat dit schriftelijk protocol en de bijbehorende video zal dienen als een waardevol leermiddel.

Protocol

1 Voorbereiding van Larven Vul een 35 mm petrischaal met dissectie buffer. Plaats larven in petrischaal en hen in staat stellen om rond te zwemmen voor een paar minuten (zelfreinigende stap). Transfer larven tot een pool van dissectie buffer op basis van siliconen dissectie plaat. Dit zwembad moet aan de ene rand van de plaat. De dissectie plaat bestaat uit een siliconen oplossing werd gegoten en gehard in een glazen petrischaal. Met behulp van een pasteur-pipet, plaats een grote…

Representative Results

De methode die hiervoor betrouwbaar wordt beschreven produceert hoogwaardige materiaal voor analyse met in situ sondes, transcriptie verslaggevers, eiwit vallen en antilichamen. In figuur 1 geven we oog-antenne, genitale, vleugel, haltere en been schijven die routinematig worden hersteld met deze methode. Deze schijven werden behandeld met een falloïdine-geconjugeerd fluorofoor, dat bindt aan F-actine en derhalve schetst elke cel. Wanneer het weefsel is goed dan vastgestelde morfogenetische gr…

Discussion

Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en k…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples