解剖や成虫の免疫染色から<em>キイロショウジョウバエ</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

ショウジョウバエにおけるポスト胚発生のかなりの部分、 キイロショウジョウバエは 、成虫と呼ばれる袋状構造のセット内で行われます。これらのディスクは、大人のハエ内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせる。ここでは、これらのディスクを回復し、抗体、転写レポーターとタンパク質トラップを用いた分析のためにそれらを準備するために最適化されたプロトコルを記述します。この手順では、成虫のような薄い組織に最も適しているが、簡単にそのような幼虫の脳と大人の卵巣厚い組織に使用するために修正することができます。書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは3齢幼虫、組織の固定、および抗体と成虫の治療の切開を介してリーダ/ビューアをご案内いたします。プロトコルは、同様に若い第一及び第二齢幼虫から成虫を分析するために使用することができます。このプロトコルの利点は、比較的短く、それがいることである解剖した組織の高品質保持のために最適化が備わっています。別の利点は、使用される固定手順ショウジョウバエタンパク質を認識する抗体の圧倒的な数でうまく動作することである。われわれの経験では、この手順ではうまく機能しない敏感な抗体の非常に小さな数があります。このような状況では、救済策は、私たちが解剖工程および抗体インキュベーションのために記載されているガイドラインに従うことを継続しながら、代替の固定カクテルを使用することであるように思われる。

Introduction

一世紀以上ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエの場合は、開発、行動や生理機能を研究するための最高のシステムとなっている。成虫^1-3と呼ばれる単層の上皮内後者の撮影場所の多くで胚および後胚：ハエにおける開発は、二つの大きな段階に分けることができる。 成虫の図面は最初の昆虫開発¹の彼の広範な研究論文の一部として8月ワイスマンによって1864年に出版された。これらのディスクは^{、1〜14のフライ} 、大人内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせ、最終的には初期の蛹の段階の大規模な組織分解を生き残る、と、幼虫の段階でパターニングして、胚形成の間彼らの開発を開始。幼虫の開発中に各ディスクには運命、形状やサイズに関するいくつかの重要な決定を行う。第一及び第二の幼虫齢の中では、ディスクはestablisは、原発運命を採用する使命を帯びている正確な形状を採用し、セル^15〜16の必要な数を生成し、コンパートメントの境界を興。第三の幼虫齢と初期のプレ蛹段階では、成虫は分裂を続け、細胞がそれらの端末の運命^16を採用するようにパターニングする。

ショウジョウバエ発生生物学の初期の歴史の中で、成虫は正常な発達との関連で、損失または機能獲得変異体が生存された限られたケースではほぼ独占的に研究した。幼虫および成体組織内の細胞クローン中で分析される致死突然変異のために許可された有糸分裂組換えを誘導するX線の使用。この方法は、幼虫および成体の両方の組織における損失と機能獲得型突然変異を分析するためにトランスジェニック法の導入により改善されている。野生型および変異型の組織の分子景観を説明するための抗体の転写レポーターおよびタンパク質トラップの数も定数であるantly成長。損失を分析し、機能獲得型変異細胞クローンするために、これらの分子マーカーを使用すると、突然変異細胞は、発達中にその野生型いとこから逸脱方法のリアルタイムの理解を得ることがますます可能になった。適切にこれらのツールおよび試薬を利用するためには、閲覧撮影し分析することができる成虫の高品質の製剤を有することが重要である。この原稿の目標は、目を触角複合体（ 図1A）の単離および調製のための最適化されたプロトコルを提供することです。また、正常翼、平均棍、T1-T3脚および性器（ 図1B-E）を生じるものを含む追加のディスクの多種多様な単離することができる。この手順は、わずかな変更で、ほぼ80年間、 ショウジョウバエ成虫を単離するために使用されている。

ほとんどの遺伝子は、ミュー中に発現されているので、上記のように発達段階ltipleおよび組織の多数では、動物が三齢幼虫期前によく死ぬようにヌル変異体が眼全体に与える影響を研究するために、多くの場合不可能です。 4つの方法は、網膜などの先進の組織の研究は著しくより扱いやすくなりました。最初は、そうでなければ、野生型組織^17-19内の変異体細胞クローンを生成するフリッパーゼ（FLP）/フリッパーゼ換えターゲット（FRT）メソッドです。この場合、変異体組織は、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような視覚的なマーカーの非存在により識別され、GFPの存在する周囲の野生型組織（ 図2D）と比較することができる。二つ目は、導入遺伝子が細胞²⁰の集団において発現している「FLPアウト」方式である。この場合、細胞クローンは、GFPレポーターを欠いている周囲の野生型組織（ 図にGFPの存在によって同定され、比較される2E）。第三は、FLP / FRT突然変異体クローンとFLPアウト発現システム²¹の要素を組み合わせた抑制性細胞マーカー（MARCM）技術とモザイクの分析である。この方法では、導入遺伝子を同時に個体の遺伝子座のための突然変異体である細胞の集団内で表現することができる。 FLPアウトクローンと同様に、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定およびGFPマーカー（ 図2F）を欠いている周囲の野生型組織と比較している。最後に、遺伝子及びRNAi構築物は、特異的プロモーター-GAL4構築物の制御下成虫組織内で発現させることができる。変異または過剰発現クローンまたはパターンが直接隣接野生型組織と比較することができるので、これらの4つの方法は、成虫の研究に関心が高まっている。この手順に記載された方法が開発されているように、ショウジョウバエでは、成体組織の後胚発生を研究、研究者、特に目を触角から誘導されるものが、分析のために高品質の組織を得ることができるであろう。個別の研究者は、わずかな変更を行ってきたが、（私たちはここで説明する）この手順のコアは、大部分が変更されていないままである。高品質の組織を得ることが私たちは、この書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは貴重な教育資源として役立つことを願ってい成虫の研究に重要であることから。

Protocol

幼虫の調製解剖バッファーで35ミリメートルペトリ皿を埋める。 ペトリ皿に幼虫を置き、それらを数分間（セルフクリーニング工程）の周りに泳ぐことができます。 シリコーン系解剖板に解剖バッファーのプールに幼虫を転送します。このプールは、プレートの一方の端にあるべきである。解剖板はガラスシャーレ内注入し、硬化したシリコーン溶液で構成されていま?…

Representative Results

確実に上述した方法は、その場プローブ 、転写レポーター、タンパク質トラップおよび抗体中での分析のための高品質の素材を生成します。 図1では、私たちが日常的にこの方法で回収されたアイ·アンテナ、性器、翼、平均棍と脚のディスクを表示します。これらのディスクは、F-アクチンに結合し、従って、各セルの概要を説明ファロイジン結合体化フルオロフ?…

Discussion

この手順は、主に目を触角ディスクの単離およびその後の治療に焦点を当ててきたが、それは翼、平均棍、足や性器ディスク（ 図4）を単離および分析するために使用されることに適している。 （目を触角ではなく）これらのディスクを分離するためのプロトコルの唯一の必須修正は、粗い解剖（プロトコルのセクション2）の方法である。第一胸椎の脚（T1）のペアは、幼虫の?…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples