Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Une partie importante du développement post-embryonnaire chez la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a lieu au sein d'un ensemble de structures de sac-comme les appelés disques imaginaux. Ces disques donnent lieu à un pourcentage élevé de structures adultes qui se trouvent à l'intérieur de la mouche adulte. Nous décrivons ici un protocole qui a été optimisé pour récupérer ces disques et de les préparer pour l'analyse avec des anticorps, des journalistes de la transcription et les pièges de protéines. Cette procédure est plus adapté pour les tissus légers tels que les disques imaginaux, mais peut être facilement modifié pour une utilisation avec des tissus plus épais tels que le cerveau adulte et larvaire ovaire. Le protocole écrit et la vidéo qui accompagne va guider le lecteur / spectateur à travers la dissection de troisième stade larvaire, fixation de tissu, et le traitement des disques imaginaux avec des anticorps. Le protocole peut être utilisé pour disséquer les disques imaginaux de jeunes larves de premier et deuxième stade aussi. L'avantage de ce protocole est qu'il est relativement court et il a êtrefr optimisé pour la préservation de haute qualité du tissu disséqué. Un autre avantage est que la procédure de fixation qui est utilisé fonctionne bien avec la très grande majorité des anticorps qui reconnaissent des protéines de Drosophila. Dans notre expérience, il ya un très petit nombre d'anticorps sensibles qui ne fonctionnent pas bien avec cette procédure. Dans ces situations, le remède semble être d'utiliser une fixation cocktail autre tout en continuant à suivre les lignes directrices que nous avons définies pour les étapes de dissection et les incubations d'anticorps.

Introduction

Depuis plus d'un siècle, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été un principal système pour étudier le développement, le comportement et la physiologie. Développement de la mouche peut être divisé en deux grandes étapes: embryonnaires et post-embryonnaires avec beaucoup de celle-ci ayant lieu au sein de l'épithélium monocouche appelés disques imaginaux ^1-3. Dessins de disques imaginaux ont d'abord été publiés en 1864 par Août Weismann dans le cadre de son vaste monographie sur le développement des insectes ^1. Ces disques commencent leur développement au cours de l'embryogenèse, sont motifs pendant les stades larvaires, survivre à la histolyse massive des pupes début, et finalement donner lieu à un pourcentage élevé de structures adultes que l'on trouve au sein de la mouche adulte ^1-14. Au cours du développement larvaire chaque disque fait plusieurs décisions importantes concernant le destin, la forme et la taille. Dans les premier et deuxième stades larvaires, les disques sont chargés de l'adoption d'un sort primaire, establishing limites du compartiment, l'adoption de la forme correcte et générer le nombre requis de cellules ^15-16. Au cours du troisième stade larvaire et au début du stade pré-pupe, les disques imaginaux continuent à se diviser et sont modelées comme des cellules adoptent leurs destins terminaux ^16.

Au cours de l'histoire des débuts de la biologie du développement chez la drosophile, les disques imaginaux ont été étudiés presque exclusivement dans le contexte du développement normal et dans les cas limités où une perte ou un mutant gain de fonction était viable. L'utilisation des rayons X pour induire une recombinaison mitotique permis de mutations létales à analyser dans des clones de cellules dans les tissus de larves et d'adultes. Cette méthode a été améliorée par l'introduction de méthodes transgéniques pour analyser la perte et gain de fonction des mutations dans deux tissus larvaires et adultes. Le nombre d'anticorps, les journalistes de la transcription et les pièges de protéines pour décrire le paysage moléculaire de type sauvage et mutantes tissus est également constde plus en plus antly. L'utilisation de ces marqueurs moléculaires pour analyser la perte et gain de fonction des clones de cellules mutantes a fait de plus en plus possible d'acquérir une compréhension en temps réel de la façon dont les cellules mutantes s'écartent de leurs cousins ​​de type sauvage au cours du développement. Pour bien prendre avantage de ces outils et des réactifs, il est essentiel d'avoir des préparations de disques imaginaux qui peut être consulté, photographiés et analysés haute qualité. Le but de ce manuscrit est de fournir un protocole optimisé pour l'isolement et la préparation du complexe de disque eye-antennaire (Figure 1A). Il peut également être utilisé avec succès pour isoler une grande variété de disques supplémentaires, y compris celles qui donnent lieu à des ailes, des haltères, des jambes T1-T3 et les organes génitaux (figure 1B-E). Ce procédé, avec des modifications mineures, a été utilisée pour isoler les disques imaginaux de la drosophile pendant près de 80 années.

Comme décrit ci-dessus, étant donné que la plupart des gènes sont exprimés au cours de multiple stades de développement et dans une multitude de tissus, il est souvent impossible d'étudier les effets que les mutants nuls ont sur l'ensemble de l'œil que l'animal meurt bien avant le stade larvaire troisième stade larvaire. Quatre méthodes ont fait l'étude des tissus plus avancés tels que la rétine beaucoup plus docile. Le premier est le procédé flippase (FLP) / flippase recombinaison cible (FRT) de générer des clones de cellules mutantes dans un tissu de type sauvage ^17-19 autrement. Dans ce cas, le tissu mutant est identifié par l'absence d'un repère visuel tel que la protéine fluorescente verte (GFP) et peut être comparé au tissu environnant de type sauvage dans lequel la GFP est présente (figure 2D). La seconde est la méthode "flp-out" dans laquelle un transgène est exprimé dans une population de cellules ^20. Dans ce cas, les clones de cellules sont identifiés par la présence de GFP et par rapport au tissu environnant de type sauvage qui n'a pas le rapporteur GFP (Figure2E). Le troisième est l'analyse Mosaïque avec une technique répressible marqueur cellulaire (marcm), qui combine des éléments du clone mutant FLP / FRT et systèmes d'expression flp-out ^21. Avec cette méthode, un transgène peut être exprimé dans une population de cellules qui sont à la fois pour un mutant locus génétique particulier. Comme les clones de flp-out, marcm clones sont identifiés par la présence de GFP et comparés au tissu de type sauvage environnante qui n'a pas le marqueur GFP (Figure 2F). Et enfin, les gènes et les constructions ARNi peuvent être exprimés dans les tissus imaginaux sous le contrôle des constructions spécifiques promoteur GAL4. Ces quatre méthodes ont accru l'intérêt dans l'étude des disques imaginaux depuis clones mutants ou des motifs ou sur-expression peuvent être directement comparés aux tissus adjacents de type sauvage. La méthode décrite dans cette procédure a été mise au point afin que les chercheurs qui étudient le développement post-embryonnaire des tissus adultes chez la drosophile,notamment ceux issus de disque eye-antennaire, pourront obtenir des tissus de haute qualité pour l'analyse. Bien que les chercheurs individuels ont apporté de légères modifications, le noyau de cette procédure (que nous décrivons ici) est resté largement inchangé. Depuis l'obtention de tissus de haute qualité est essentiel à l'étude des disques imaginaux nous espérons que ce protocole écrit et la vidéo qui accompagne va servir de ressource pédagogique précieuse.

Protocol

1 Préparation de larves Remplissez une boîte de 35 mm de Pétri avec un tampon de dissection. Placez les larves en boîte de Petri et leur permettre de nager pendant quelques minutes (étape d'auto-nettoyage). Transférer les larves à un pool de mémoire tampon de dissection sur une plaque de dissection à base de silicone. Cette piscine doit être à un bord de la plaque. La plaque de dissection se compose d'une solution de silicone qui a été coulé et durci dans une boîte d…

Representative Results

La méthode décrite ci-dessus de manière fiable produit du matériel de haute qualité pour l'analyse des sondes in situ, les journalistes de la transcription, les pièges de protéines et d'anticorps. Dans la figure 1, nous affichons œil-antenne, génitales, ailes, haltère et jambes disques qui sont systématiquement récupérés avec cette méthode. Ces disques ont été traités avec un fluorophore de la phalloïdine-conjugué, qui se lie à l'actine F et décrit par conséqu…

Discussion

Bien que cette procédure ait surtout porté sur l'isolement et le traitement ultérieur des disques eye-antennaire, il est susceptible d'être utilisé pour isoler et analyser l'aile, haltère, la jambe et les disques génitales (figure 4). La seule modification nécessaire du protocole pour isoler ces disques (par opposition au disque eye-antennaire) est la méthode de dissection grossière (de l'article 2 du protocole). La première branche (T1) thoracique paire se trouve à la partie…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples