Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Abstract
Post-embriyonik meyve sineğinin gelişimi, Drosophila melanogaster önemli bir kısmı, hayali olarak adlandırılan diskler kese gibi yapıların bir dizi içinde yer alır. Bu diskler, yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açar. Burada bu diskleri kurtarmak ve antikorlar, transkripsiyon gazetecilere ve protein tuzakları ile analiz için onları hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu işlem en iyi hayali diskler gibi ince dokular için uygundur, ancak kolay gibi, larva ve yetişkin beyin yumurtalık kalın dokuları ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Yazılı bir protokol ve beraberindeki Video üçüncü larva, doku fiksasyonu ve antikorlar ile hayali diskler tedavisi diseksiyon ile okuyucu / izleyiciye rehberlik edecektir. Protokol da daha küçük olan, birinci ve ikinci instar larvalarından hayali diskleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı nispeten kısa olduğunu ve olması vardırdisseke doku yüksek kalite korunması için optimize tr. Diğer bir avantaj kullanıldığı sabitleme işlemi, Drosophila proteinleri tanıyan antikorların ezici sayı ile çalışır. Bizim tecrübelerimize göre, bu prosedürü ile iyi çalışmaz duyarlı antikorların çok küçük bir sayı vardır. Bu durumlarda, çare biz diseksiyon adımlar ve antikor inkübasyonlarının için belirlenen adres yönergeleri takip devam ederken alternatif bir sabitleme kokteyl kullanmak gibi görünüyor.
Introduction
Yüzyılı aşkın bir meyve sineği Drosophila melanogaster için, geliştirme, davranış ve fizyolojisini incelemek için önde gelen bir sistem olmuştur. Ikincisi alma yere kadar olan embriyonik ve post-embriyonik tek tabaka epitellerinden içinde hayali diskler 1-3 seslendi: sinek Kalkınma iki geniş aşamadan ayrılabilir. Hayali diskler çizimleri ilk böcek gelişimine 1 onun geniş monografi parçası olarak Ağustos Weismann tarafından 1864 yılında yayımlandı. Bu diskler 1-14 yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açan nihai olarak ilk pupa safhalarının yoğun doku çözülmesi hayatta ve larva aşamalarında desenli embriyojenez sırasında gelişme başlar. Larva gelişimi sırasında her bir disk kaderi, şekli ve büyüklüğü ile ilgili pek çok kritik kararlar alır. Birinci ve ikinci larva instars içinde, diskler, birincil kaderi benimseyerek establis görevliDoğru şekli alarak ve hücrelerin 15-16 arasında gerekli sayıda üretilmesi, bölme sınırları hing. Üçüncü larva ve erken pre-pupa aşamasında, hayali diskler bölünmeye devam ve hücreleri terminali kaderlerini 16 evlat gibi desenli.
Drosophila gelişimsel biyoloji erken tarih boyunca, hayali diskler normal gelişim bağlamında ve bir kazanç ya da kayıp fonksiyon-mutant canlı olduğu hangi sınırlı durumlarda neredeyse sadece çalışıldı. X-ışınlarının kullanımı ölümcül mutasyonlar izin mitotik rekombinasyon larva ve yetişkin dokularda hücre klonlarının analiz edilecek ikna etmek. Bu yöntem larva ve yetişkin dokularda hem de mutasyonlar kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-transgenik yöntemler giriş tarafından geliştirilmiştir. Vahşi tipli ve mutant Dokuların moleküller manzara tanımlamak için antikorlar, transkripsiyonel raportörler, ve protein tuzaklar sayısı da const 'tırantly büyüyen. Mutant hücre klonları kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-bu moleküler işaretlerini kullanarak giderek mümkün mutant hücreler gelişim sırasında, kendi vahşi tip kuzenleri sapan nasıl bir gerçek zamanlı anlayış kazanmak için yaptı. Doğru bu araçları ve reaktiflerin yararlanmak için bu inceledi fotoğraflandı ve analiz edilebilir hayali diskler yüksek kaliteli hazırlıklarını kritik öneme sahiptir. Bu yazının amacı göz antennal diski kompleksinin (Şekil 1A) 'nin izolasyonu ve hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, başarılı bir şekilde kanatlar, halteres, T1-T3 bacak ve cinsel organların (Şekil 1B-D) yol da dahil olmak üzere ek disklerin çok çeşitli izole etmek için kullanılabilir. Minör modifikasyonlarla bu prosedür, yaklaşık seksen yıldır Drosophila 'dan gelen hayali diskleri izole etmek için kullanılmıştır.
En genler mu sırasında ifade edildiği gibi, yukarıda tarif edilengelişme ve dokuların çok sayıda aşamaları ltiple, bu hayvan Üçüncü dönem larva aşamasından önce ölür null mutantlar tüm göz olması etkilerini incelemek imkansızdır. Dört yöntemler, önemli ölçüde daha uysal retina gibi daha gelişmiş dokuların çalışma yaptık. Birinci bir başka vahşi tip doku 17-19 olan mutant hücre klonları jenere arasında Flippase (FLP) / Flippase rekombinasyonu hedeflemek (STT) yöntemidir. Bu durumda, mutasyona uğramış doku, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi bir görsel işaretin olmaması ile tanımlanır ve GFP mevcut olduğu çevre vahşi tip doku (Şekil 2B) mukayese edilebilir. İkinci bir transgen hücrelerinin 20 bir popülasyonunda ifade edildiği "Flp üzerinden" yöntemidir. Bu durumda, hücre klonları, GFP raportör yoksun çevresindeki yabani tip doku (Şekil GFP varlığı ile tanımlanan ve karşılaştırılmıştır2E). Üçüncü FLP / FRT mutant klon ve bdp-dışarı ekspresyon sistemleri 21 unsurlarını birleştiren bir Baskılanabilir Hücre Marker (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi'dir. Bu yöntem ile, bir transgen, aynı anda tek bir genetik lokus için mutant bir hücre popülasyonu içinde ifade edilebilir. Flp üzerinden klonları gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tanımlanan ve GFP işaretleyici (Şekil 2F) yoksun çevreleyen vahşi tip doku ile karşılaştırılır. Ve son olarak, genler ve RNAi yapıları, GAL4 spesifik promotör-yapılarının kontrol altında hayali dokularda ifade edilebilir. Mutant veya aşırı ifadesi ya da klonlar desenler doğrudan bitişik vahşi tip dokuya göre olabilir çünkü Bu dört yöntem hayali diskleri okuyan ilgiyi artırmıştır. Bu prosedürde açıklanan gibi bir yöntem geliştirilmiştir ve böylece Drosophila yetişkin dokuların sonrası embriyo gelişimini çalışan araştırmacılar,Özellikle göz-antennal diskten türetilenler, analiz için yüksek kaliteli doku elde etmek mümkün olacaktır. Bireysel araştırmacılar küçük değişiklikler yapmış olsa da, bu prosedüre (biz burada açıklamak olan) çekirdek büyük ölçüde değişmeden kalmıştır. Yüksek kaliteli dokusu elde biz bu yazılı bir protokol ve beraberindeki görüntü değerli bir öğretim kaynağı olarak hizmet umuyoruz hayali disklerin çalışmaya kritik olduğundan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu prosedür, büyük ölçüde izole edilmesi ve göz antennal diskler daha ilerideki muamelesi odaklanmış olmakla beraber, bu izole etmek ve kanat, haltere, bacak ve genital diskleri (Şekil 4) analiz etmek için kullanılan elverişlidir. (Göz antennal diske karşı), bu diskleri izole edilmesi için protokol tek gerekli modifikasyon kaba Diseksiyon (protokol, Bölüm 2) 'nin bir yöntemdir. İlk göğüs ayağı (T1), bir çift larva anterior bulunur ve göz antennal disk izolasyonu için pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz JPK orijinal hayali disk diseksiyonu işlemini öğretirken Donald hazır ve Kevin Musa'yı teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Şekil 1B genital disk ve Şekil 3 Şekil 2A Brandon Weasner, göz diski Bonnie Weasner ederiz, sinek lekelere Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası. CMS Sağlık (NIH) GCMS Eğitim Grant National Institutes (T32-GM007757), Frank W. Putnam Araştırma Bursu ve Robert Briggs Araştırma Bursu bir nakit tarafından desteklenmiştir. JPK Ulusal Göz Enstitüsü bir hibe ile desteklenen (R01 EY014863)
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
| 50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
| Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
| 50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
| 1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
| Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
| Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .
- Cohen, S. M. . Imaginal disc development. , 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 165-242 (1972).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3′ cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
