נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em> Melanogaster דרוזופילה</em
Summary
The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.
Abstract
חלק משמעותי מפיתוח שלאחר עוברי בזבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מתרחש בתוך מערכת של מבנים דמויים כיס נקראים דיסקים דמותי. תקליטורים אלה להצמיח אחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך הזבוב הבוגר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי כבר מותאם להתאושש הדיסקים הללו ולהכינם לניתוח עם נוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון. הליך זה הוא מתאים ביותר לרקמות דקות כמו דיסקים דמותי, אבל ניתן לשנות בקלות לשימוש עם רקמות עבות יותר כגון השחלה המוח ומבוגר זחל. הפרוטוקול נכתב והסרטון נלווה ידריכו את הקורא / צופה באמצעות הנתיחה של זחלים שלישיים instar, קיבעון של רקמה, וטיפול בדיסקים דמותי עם נוגדנים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי לנתח דיסקים דמותי מזחלי instar הראשון והשני צעירים יותר, כמו גם. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא קצר יחסית ויש לה להיותen מותאם במיוחד לשימור באיכות הגבוהה של הרקמה גזור. יתרון נוסף הוא שהליך הקיבעון שמועסק עובד היטב עם המספר העצום של נוגדנים המזהים חלבוני דרוזופילה. מניסיוננו, יש מספר קטן מאוד של נוגדנים רגישים שלא עובדים היטב עם הליך זה. במצבים אלה, התרופה נראית להשתמש קוקטייל קיבעון חלופי תוך המשך פעל בהתאם להנחיות שיש לנו, שנקבעו עבור צעדים לנתיחה וincubations נוגדן.
Introduction
במשך יותר ממאה שנת זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הייתה מערכת מובילה ללימודי פיתוח, התנהגות ופיזיולוגיה. פיתוח בזבוב יכול להיות מחולק לשני שלבים עיקריים: עובריים ופוסט עובריים עם הרבה מקום הלקיחה האחרון בתוך epithelia monolayer נקראים דיסקים דמותי 1-3. ציורים של דיסקים דמותי פורסמו לראשונה בשנת 1864 עד אוגוסט וייסמן, כחלק ממונוגרפיה הרחבה שלו על פיתוח 1 חרקים. תקליטורים אלה להתחיל בפיתוחם במהלך עובר, הם בדוגמת בשלבי הזחל, לשרוד histolysis המסיבי של שלבי גלמים המוקדמים, וסופו של דבר לגרום לאחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך המבוגר לטוס 1-14. במהלך התפתחות זחל כל דיסק עושה כמה החלטות קריטיות לגבי גורל, צורה וגודל. בתוך instars הזחל הראשון והשני, הדיסקים המוטל עם אימוץ גורל עיקרי, establisהינג גבולות תא, אימוץ הצורה הנכונה ויוצר את המספר הדרוש של תאי 15-16. במהלך instar הזחל השלישי והשלב טרום גלמים מוקדמים, הדיסקים דמותי ממשיכים להתחלק והם בדוגמת תאים לאמץ גורל המסוף שלהם 16.
במהלך ההיסטוריה המוקדמת של ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה, דיסקים דמותי נחקרו כמעט באופן בלעדי בהקשר של התפתחות נורמלית ובמקרים המצומצמים שבו אובדן או מוטציה רווח של הפונקציה היה קיימא. השימוש בקרן רנטגן כדי לגרום רקומבינציה mitotic אפשרה למוטציות קטלניות להיות מנותחת בשיבוטי תאים בתוך רקמות זחל ומבוגרים. שיטה זו שופרה על ידי ההקדמה של שיטות מהונדסים לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית מוטציות בשתי רקמות זחל ומבוגרים. מספר הנוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון לתיאור הנוף המולקולרי של סוג בר ורקמות מוטציה הוא גם constantly גובר. שימוש בסמנים מולקולריים אלה כדי לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית שיבוטים תא שעבר מוטציה עשה את זה אפשרי יותר ויותר כדי להשיג הבנה של הדרך בה תאים שעברו מוטציה לסטות מבני דודים מהסוג הברים במהלך פיתוח בזמן אמת. כדי לנצל את הכלים וחומרים הכימיים הללו כראוי זה הוא קריטי ליש הכנות באיכות גבוהות של דיסקים דמותי שניתן לראות, צילמו וניתחו. המטרה של כתב יד זה היא לספק פרוטוקול מותאם במיוחד לבידוד והכנת המורכבת דיסק העיניים מחושים (איור 1 א). זה גם יכול לשמש בהצלחה לבודד מגוון רחב של דיסקים נוספים כוללים אלה שיוצרים כנפיים, הבוכניות, רגלי T1-T3 ואיברי המין (איור 1 ב-E). הליך זה, עם שינויים קלים, נעשה שימוש כדי לבודד דיסקים דמותי מדרוזופילה במשך כמעט שמונים שנה.
כפי שתואר לעיל, שכן רוב הגנים באים לידי ביטוי במהלך multiple שלבי התפתחות ובמספר רב של רקמות, הוא לעתים קרובות בלתי אפשרי לחקור את ההשפעות שיש לי מוטציות null בכל עין כחיה מתה הרבה לפני שלב זחל instar השלישי. ארבע שיטות שעשו המחקר של רקמות מפותחות יותר כגון הרשתית באופן משמעותי יותר צייתן. הראשון הוא שיטת Flippase (FLP) / Flippase רקומבינציה היעד (FRT) של יצירת שיבוטים תא שעברו מוטציה בתוך רקמת סוג אחר פראית 17-19. במקרה זה רקמת המוטציה מזוהה על ידי היעדר סמן חזותי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויכולה להיות בהשוואה לרקמה הסובבת הפראית הסוג שבו GFP הוא הווה (איור 2 ד). השני הוא השיטה "FLP-out", שבי transgene באה לידי ביטוי באוכלוסייה של תאים 20. במקרה זה השיבוטים התא מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה הסובבת הסוג בר שחסרה את כתב GFP (איור2E). השלישי הוא ניתוח הפסיפס עם טכניקת סמן תא Repressible (MARCM), המשלבת אלמנטים של שיבוט המוטציה FLP / FRT ומערכות ביטוי FLP-out 21. בשיטה זו transgene יכול לבוא לידי ביטוי בתוך אוכלוסייה של תאים שנמצאים בו זמנית מוטציה למוקד גנטי בודד. כמו שיבוטים FLP-out, שיבוטים MARCM מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה מהסוג בר שמסביב שחסרה את סמן GFP (איור 2F). ולבסוף, ניתן לבטא את הגנים ומבני RNAi בתוך רקמות דמותי תחת שליטתו של בונה האמרגן-GAL4 ספציפי. ארבע שיטות אלה הגדילו את הריבית בלומד דיסקים דמותי מאז שיבוטים או דפוסי מוטציה או על ביטוי ניתן להשוות ישירות לרקמה מסוג בר סמוכה. השיטה המתוארת בהליך זה פותחה כך שחוקרים הלומדים את התפתחות פוסט העוברית של רקמות בוגרות בדרוזופילה,במיוחד אלה הנגזרים מדיסק העיניים מחושים, יוכל להשיג רקמה באיכות גבוהה לניתוח. למרות שחוקרים פרטיים שעשו שינויים קלים, הליבה של הליך זה (שבו אנו מתארים כאן) נותרה במידה רבה ללא שינוי. מאז קבלת רקמה באיכות גבוהה היא קריטית למחקר של הדיסקים דמותי אנו מקווים פרוטוקול זה נכתב וסרטון נלווה ישמשו כמשאב יקר ערך הוראה.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שהליך זה במידה רבה התמקד בבידוד והטיפול הבא של דיסקי עיניים מחושים, זה ניתן לשימוש כדי לבודד ולנתח את הכנף, הבוכניות, הרגל ודיסקים באברי המין (איור 4). השינוי הנדרש היחיד של הפרוטוקול לבידוד הדיסקים הללו (בניגוד לדיסק העיניים מחושים) הוא השיטה של נתיח…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לדונלד מוכן וקווין משה להוראת JPK הליך נתיחת דיסק דמותי המקורי. אנו מודים גם לבונים Weasner לדיסק באברי המין באיור 1 ואת דיסק עין באיור 2 א, ברנדון Weasner לאיור 3, מרכז Bloomington דרוזופילה המלאי לכתמי זבוב ובנק Hybridoma התפתחותית לימודים לנוגדנים. CMS כבר נתמך על ידי מלגה מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) GCMS הדרכת גרנט (T32-GM007757), פרנק וו Putnam מלגת המחקר, ורוברט בריגס מלגת המחקר. JPK נתמך על ידי מענק מהעין הלאומית (R01 EY014863)
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150x20mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | N/A | Used for fixation of imaginal disc complexes |
| 50ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | N/A | |
| Small Stir Bar | Various Vendors | N/A | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask |
| 50ml Conical Tubes | Various Vendors | N/A | |
| 1.5ml Microfuge Tubes | Various Vendors | N/A | Clear or Dark depending upon application |
| Microfuge Rack | Various Vendors | N/A | |
| Benchtop Rotator | Various Vendors | N/A | 100ul volume should not splatter at low setting |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum` | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Seondary Antibodies | Various Vendors | N/A | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18x18mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | NA | Prevents Glass slides from adhering to silicone base |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | NA | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .
- Cohen, S. M. . Imaginal disc development. , 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 165-242 (1972).
- Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. , 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3′ cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
