Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Ein wesentlicher Teil der Post-embryonalen Entwicklung in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, findet innerhalb einer Reihe von sackartigen Strukturen genannt Imaginalscheiben. Diese Scheiben führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in die erwachsene Fliege zu finden sind. Hier haben wir ein Protokoll, das so optimiert wurde, um diese Scheiben zu erholen und bereiten sie für die Analyse mit Antikörpern, Transkriptions Reporter und Protein-Traps zu beschreiben. Dieses Verfahren ist am besten für dünne Gewebe wie Imaginalscheiben geeignet, kann aber leicht für die Verwendung mit dicker Gewebe modifiziert werden, wie die Larven und erwachsene Gehirn Eierstock. Die schriftliche Protokoll und begleitende Video den Leser / Betrachter durch die Zerlegung des dritten Larvenstadium, Fixierung von Gewebe, und die Behandlung von Imaginalscheiben mit Antikörpern führen. Das Protokoll kann verwendet werden, um Imaginalscheiben von jüngeren ersten und zweiten Larvenstadium sowie sezieren werden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, daß sie relativ kurz ist, und es hat seinen für die hohe Qualität Erhaltung der sezierten Gewebe optimiert. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fixierung Verfahren, das eingesetzt wird, funktioniert gut mit der überwiegenden Anzahl von Antikörpern, die Drosophila-Proteine ​​zu erkennen. Nach unserer Erfahrung gibt es eine sehr kleine Anzahl von empfindlichen Antikörper, die nicht gut mit diesem Verfahren arbeiten. In diesen Situationen wird das Heilmittel zu sein, um eine alternative Fixierung Cocktail nutzen und dabei die Richtlinien, die wir weiter für die Dissektion Schritte und Antikörperinkubationen haben zu folgen.

Introduction

Seit mehr als einem Jahrhundert die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist einer der führenden System-Entwicklung, Verhalten und Physiologie zu studieren. Embryonalen und post-embryonale mit viel der letzteren stattfindet in Mono Epithelien genannt Imaginalscheiben ^1-3: Entwicklung in der Fliege können in zwei große Phasen unterteilt werden. Zeichnungen von Imaginalscheiben wurden erstmals im Jahre 1864 von August Weismann als Teil seines breiten Monographie über Insektenentwicklung ¹ veröffentlicht. Diese Scheiben ihrer Entwicklung beginnen während der Embryogenese, werden während der Larvenstadien gemustert, überleben die massiven Histolyse der frühen Puppenstadien und schließlich führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in der Erwachsenen gefunden werden fliegen ^1-14. Während Larvenentwicklung jede Scheibe macht mehrere kritische Entscheidungen in Bezug auf das Schicksal, Form und Größe. Innerhalb der ersten und zweiten Larvenstadien werden die Discs mit der Annahme einer primären Schicksal beauftragt, establisHing Fach Grenzen, die Annahme der richtigen Form und die Erzeugung der erforderlichen Anzahl von Zellen ^15-16. Während des dritten Larvenstadium und frühen Pre-Puppenstadium, die Imaginalscheiben weiter teilen und strukturiert, wie Zellen ihre Schicksale Terminal ¹⁶ erlassen.

Während der frühen Geschichte der Drosophila Entwicklungsbiologie, wurden fast ausschließlich Imaginalscheiben im Rahmen der normalen Entwicklung und in den wenigen Fällen, in denen ein Verlust oder Gewinn-of-function-Mutante lebensfähig war sucht. Die Verwendung von Röntgenstrahlen zu veran mitotische Rekombination zur letalen Mutationen erlaubt, in Zellklone in den Larven und erwachsenen Geweben analysiert werden. Dieses Verfahren wurde durch die Einführung von transgenen Verfahren verbessert worden, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function Mutationen sowohl Larven und adulten Geweben. Die Anzahl der Antikörper, Transkriptions Reporter und Protein-Traps für die Beschreibung der molekularen Landschaft von Wildtyp und Mutante Gewebe ist auch constantly wächst. Mit Hilfe dieser molekularen Marker, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function-Mutante Zellklone hat es immer möglich, eine Echtzeit-Verständnis, wie mutierten Zellen während der Entwicklung von ihren Wildtyp abweichen Vettern zu gewinnen. Um richtig nutzen diese Werkzeuge und Reagenzien ist es wichtig, qualitativ hochwertige Präparate von Imaginalscheiben, die angezeigt werden können, fotografiert und analysiert haben. Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Herstellung der augenAntennenScheibe Komplex (Figur 1A) zu liefern. Es kann auch erfolgreich verwendet, um eine Vielzahl von zusätzlichen Scheiben einschließlich derjenigen, die zu den Flügeln halteres, T1-T3 Beine und die Genitalien (1B-E) erhalten wird, zu isolieren. Dieses Verfahren, mit geringfügigen Modifikationen, wurde verwendet, um Imaginalscheiben von Drosophila für fast 80 Jahre zu isolieren.

Wie oben beschrieben, da die meisten Gene während mu exprimiertltiple Entwicklungsstufen und in einer Vielzahl von Geweben, ist es oft nicht möglich, die Effekte zu untersuchen, dass Null-Mutanten wurden auf der gesamten Augen das Tier stirbt, und vor dem dritten Larvenstadium Larvenstadium. Vier Methoden wurden die Untersuchung weiter entwickelten Geweben wie der Retina wesentlich leichter handhabbar gemacht. Die erste ist die Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) Verfahren zur Erzeugung von Mutanten-Zellklone in einem ansonsten Wildtyp-Gewebe ^17-19. In diesem Fall wird das mutierte Gewebe wird durch das Fehlen einer visuellen Markierung, wie Green Fluorescent Protein (GFP) identifiziert und an die umliegenden Wildtyp-Gewebe, in dem GFP vorhanden ist (2D) verglichen werden. Das zweite ist das "FLP-out"-Methode, in der ein Transgen in einer Population von Zellen ²⁰ ausgedrückt. In diesem Fall sind die Zellklone werden durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und auf die umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Reporter fehlt (Abbildung Vergleich2E). Die dritte ist die Mosaik-Analyse mit einem Reprimierbare Zellmarker (MARCM)-Technik, die Elemente des FLP / FRT-Mutante Klon und FLP-out-Expressionssysteme ²¹ verbindet. Mit diesem Verfahren wird ein Transgen in einer Population von Zellen, die gleichzeitig für einen einzelnen mutierten genetischen Locus exprimiert werden. Wie FLP-out-Klone sind Klone MARCM durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und im Vergleich zu den umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Markierung (2F) fehlt. Und schließlich können die Gene und RNAi-Konstrukten in imaginal Gewebe unter der Kontrolle spezifischer Promotor GAL4-Konstrukten exprimiert werden. Diese vier Methoden haben das Interesse an einem Studium Imaginalscheiben seit Mutante oder Überexpression Klone oder Muster können direkt miteinander verglichen werden, um benachbarte Wildtyp-Gewebe erhöht. Die in diesem Verfahren beschriebenen Methode wurde so entwickelt, dass Forscher, die die post-embryonale Entwicklung von adulten Geweben in Drosophila zu untersuchen,insbesondere aus dem Blickantennenscheibe stammen, werden in der Lage, qualitativ hochwertige Gewebe für die Analyse zu erhalten. Obwohl einzelne Forscher haben leichte Modifikationen vorgenommen, hat der Kern dieses Verfahrens (die wir hier beschreiben) weitgehend unverändert geblieben. Seit Erlangung hochwertigen Gewebe ist entscheidend, um das Studium der Imaginalscheiben wir hoffen, dass dieses Protokoll geschrieben und dazugehörige Video wird als wertvolles Lehrmittel dienen.

Protocol

1. Herstellung von Larven Füllen Sie eine 35 mm Petrischale mit Dissektion Puffer. Zeigen Larven in Petrischale und es ihnen ermöglichen, um für ein paar Minuten (Selbstreinigungsschritt) zu schwimmen. Übertragen Larven zu einem Pool von Präparation Puffer auf Silikonbasis Schneideplatte. Dieser Pool ist an einer Kante der Platte ist. Die Schneideplatte aus einer Silikonlösung, die gegossen wurde und in einer Glaspetrischale ausgehärtet. Mit einer Pasteurpipette, legen Sie…

Representative Results

Die Methode, die oben beschrieben ist zuverlässig produziert hochwertige Material für die Analyse mit In-situ-Sonden, Transkriptions Reportern, Protein-Traps und Antikörper. In Abbildung 1 zeigen wir Augen Antenne, genital, Flügel, Haltere und Beinscheiben, die routinemäßig mit diesem Verfahren gewonnen werden. Diese Scheiben sind mit einer Phalloidin-konjugierten Fluorophor, die F-Aktin bindet und daher beschreibt jede Zelle behandelt. Wenn das Gewebe richtig dann die morphogenetischen F…

Discussion

Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf die Isolierung und nachfolgende Behandlung von Augenantennenscheiben konzentriert, ist es zugänglich ist zur Isolierung und Analyse des Flügels Haltere, Bein-und Genitalscheiben (4). Die einzige erforderliche Änderung des Protokolls zur Isolierung dieser Scheiben (im Gegensatz zum Auge-Antennenscheibe) ist die Methode der Grob Dissektion (Abschnitt 2 des Protokolls). Die ersten Brustbein (T1) Paar wird an der vorderen der Larve gefunden und kann durch das Prot…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples