Summary
Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.
Abstract
Le cœur embryonnaire du poisson zèbre est composé de seulement quelques centaines de cellules, qui ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon. Par conséquent, afin d'empêcher le transcriptome cardiaque d'être masqué par le transcriptome embryonnaire mondiale, il est nécessaire de collecter un nombre suffisant de coeurs pour d'autres analyses. En outre, comme le développement cardiaque poisson zèbre se déroule rapidement, collection de coeur et des méthodes d'extraction d'ARN ont besoin d'être rapide afin d'assurer l'homogénéité des échantillons. Ici, nous présentons un protocole de dissection manuelle rapide pour la collecte coeurs fonctionnels / battant à partir d'embryons de poisson zèbre. Ce est une condition essentielle pour l'extraction de l'ARN spécifiquement cardiaque ultérieure pour déterminer les niveaux d'expression de gènes spécifiques cardiaque par analyse du transcriptome, comme quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR). Le procédé est basé sur les propriétés adhésives différentielles du poisson zèbre embryonnaire cœur par rapport à d'autres tissus; ce qui permet pour la PHY rapidela séparation des sique du tissu cardiaque extracardiaque par une combinaison de la perturbation de la force de cisaillement fluidique, la filtration par étapes et la collecte manuelle des transgéniques coeurs marqués par fluorescence.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en biologie du développement à étudier l'organogenèse in vivo en raison de son développement embryonnaire rapide, transparente et extra-utérine, combinée avec la petite taille et de la disponibilité de lignes de journaliste transgéniques avec expression tissu-spécifique de protéines fluorescentes. Ce petit vertébré est particulièrement bien adapté pour étudier le développement de coeur parce que l'oxygénation de l'embryon de poisson zèbre début ne repose pas sur du rythme cardiaque et la circulation sanguine; ces caractéristiques ont permis la caractérisation d'un grand nombre de mutants cardiovasculaires 1,2 et le poisson zèbre est maintenant un organisme modèle largement reconnu pour étudier les maladies cardiaques 3.
Pour étudier l'expression des gènes au cours du développement embryonnaire, les transcriptions sont généralement analysées par l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6, ou microarrays séquençage de prochaine génération (ARN-Seq) 7. Tandis queWISH permet une analyse spatio-temporelle de l'expression des gènes dans l'ensemble embryon, les niveaux de transcription sont habituellement évaluée par RT-PCR quantitative, des puces ou des approches d'ARN-Seq. Cependant, ces procédés nécessitent un enrichissement spécifique de tissu pour le profilage de l'expression génique.
Étant donné que le cœur embryonnaire du poisson zèbre ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon, les études du transcriptome au cours du développement cardiaque nécessitent un protocole de dissection et l'enrichissement des cœurs. En outre, pour obtenir des données physiologiquement pertinentes, il est important de maintenir le tissu cardiaque entièrement fonctionnel jusqu'à l'extraction d'ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler rapidement physiologiquement normal et le cœur battant de centaines d'embryons de poisson zèbre pour obtenir efficacement des échantillons d'ARN de haute qualité pour des analyses ultérieures. La présente méthode est basée sur le protocole rapporté par Burns et MacRae, 2006 8. Pour l'enrichissement du tissu cardiaque, les deux méthodes utilisent une ligne rapporteur infarctus transgéniqueet de profiter des propriétés d'adhérence différentielle de cœurs embryonnaires de poisson zèbre par rapport aux autres tissus. En bref, par pipetage de nombreux embryons monter et descendre dans une pipette étroite, coeurs sont diffusés simultanément des organismes embryonnaires et ensuite séparés des débris embryonnaire en deux étapes rapides de filtration; coeurs marqués par fluorescence sont ensuite triées manuellement à partir de débris restants et recueillies pour un traitement ultérieur.
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Protocol
Ce protocole suit les directives de protection des animaux de la loi allemande et de l'État de Berlin; la manipulation du poisson zèbre a été contrôlée par l'autorité locale pour la protection des animaux (LaGeSo, Berlin-Brandebourg).
1. Obtenir embryons de poissons zèbres pour l'extraction de coeur
- Croix journaliste poisson zèbre cardiaque tels que la Tg (myl7: EGFP) twu34 lignée transgénique neuf afin d'obtenir des embryons avec la GFP expression spécifique cardiaque.
- Maintenir les embryons dans l'eau d'œuf à 28,5 ° C jusqu'à ce que le stade embryonnaire souhaité 10,11. Assurez-vous que la population d'embryons collectés est homogène génétiquement et par stade de développement pour limiter les variations dans l'expression des gènes.
- Dechorionate les embryons manuellement.
2. dissection de poisson-zèbre coeurs embryonnaires
NOTE: Gardez toutes les solutions sur la glace. Si possible, faire le travail d'équipe: une personne dissèque les cœurs de l'embryô tandis qu'une autre personne trie les âmes sous le stéréomicroscope de fluorescence. Ceci permet le traitement de plusieurs centaines d'embryons en quelques heures.
- Transférer environ 100 embryons dans un tube de 1,5 ml de centrifugation. Anesthésier les embryons avec de tricaïne (0,16 mg / ml dans du milieu E3). Procéder une fois que les embryons sont clairement anesthésiés (ils ne savent pas nager et les sédiments au fond du tube, mais leurs cœurs sont encore battre).
- Retirer la solution / E3 de tricaïne et laver les embryons une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS et de maintenir sur la glace.
NOTE: Le milieu FBS L-15/10% est important de garder les organes et les cellules vivantes pendant la procédure de dissection ensemble jusqu'à ce que les cœurs ont été transférés dans RNAlater ou Trizol. - Ajouter 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS aux embryons et la pipette de haut en bas 5-8 fois avec un chargement de gel pointe ronde jusqu'à ce que le jaune est complètement perturbé. Pipette les embryons goutte à goutte sur la surface de la solution, de sorte que la baisse va éclater etles embryons sont doucement perturbés.
NOTE: Comment vigoureusement et à quelle fréquence les embryons doivent être pipette de haut en bas dépend du stade de développement des embryons, soit plus pipetage est nécessaire à un stade avancé (par exemple à 56 HPF). - Pour le premier lot d'embryons disséqués, évaluer l'intégrité des embryons et la proportion des cœurs disséqués sous un stéréomicroscope, puisque certains coeurs peuvent rester attachées aux embryons si trop délicatement la pipette. Réglez le mode de pipetage pour les prochains tours de dissection en conséquence.
REMARQUE: Utiliser des embouts de pipette rétention bas et microtubes de minimiser coeurs coller au plastique. - Appliquer l'échantillon sur un filtre de 100 um placé sur un tube de 50 ml de centrifugation; rincer le tube de 1,5 ml avec 1 ml de milieu L-15/10% de FBS, puis d'appliquer ce filtre dans le but de minimiser la perte de l'échantillon (quelques cœurs peuvent adhérer aux parois du tube). Laver le filtre deux fois avec 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Dans cette étape les coeurs passent à travers le filtre et sont recueillis dans le tube de 50 ml.
- Appliquer l'écoulement sur un filtre 30 um placé sur un tube de 15 ml de centrifugation et rincer le filtre une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS. Dans cette deuxième étape de filtration, les coeurs sont retenues dans le filtre et les débris plus petits est éliminé par lavage.
- Tournez le filtre à l'envers et rincer les coeurs sur le filtre dans un plat de 1% d'agarose revêtues de Pétri en appliquant trois lavages consécutifs avec 1 ml de L-15/10% de FBS.
- De séparer manuellement les cœurs GFP-positives de débris embryonnaires non fluorescent (par exemple des lentilles oculaires) avec une paire de pinces sous un stéréomicroscope à fluorescence et les concentrer dans le centre de l'assiette. Collectionnez-les selon l'étape 3.
NOTE: Si les embryons sont plus âgés que 24 HPF, les cœurs doivent être battent, ce qui indique que les tissus sont encore physiologiquement normal.
3. Isolement de l'ARNm de dissectionCoeurs TED
- Recueillir les coeurs dans le plus petit volume possible (par exemple 10 pi) et la pipette dans un tube de 1,5 ml contenant 0,75 ml RNAlater (sur la glace). Vérifiez qu'aucune coeurs restent dans la pointe de la pipette en la considérant sous un stéréomicroscope à fluorescence.
- En variante, si une hotte chimique est disponible dans le voisinage immédiat du microscope à fluorescence, le transfert dans les cœurs recueillies Trizol (ATTENTION) sous le capot chimique. Cela évite la perte possible de coeurs collage dans la pointe de pipette et également pendant la centrifugation des coeurs (étapes 3.4, 3.5 et 3.7). Mutualiser les cœurs de plusieurs séries d'isolement dans le même tube avec Trizol et aller directement à l'étape 3.8; le volume final ne doit pas dépasser 10% du volume initial Trizol.
REMARQUE: Lire le Trizol Fiche de données de sécurité (FDS) avant utilisation. Poignée réactif Trizol sous une hotte et l'usure sur l'équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et Clothing. Retirer toutes les sources d'ignition. - Réunir les cœurs de plusieurs cycles d'isolation dans le même tube avec le RNAlater (sur glace), que l'efficacité de l'isolement de l'ARN se améliore avec la quantité de tissu recueilli. Si le volume de l'échantillon total dépasse 10% du volume de RNAlater origine, utilisez un tube supplémentaire avec 0,75 ml RNAlater pour le stockage (sur la glace).
- Centrifuger les échantillons à 15 700 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter les cœurs.
- Sous un microscope stéréoscopique à fluorescence, recueillir soigneusement autant de surnageant que possible dans une boîte de Pétri d'agarose revêtues 1% contenant 3 ml de L-15/10% de milieu FBS, mais ne pas déranger les cœurs sédimentées au fond du tube de centrifugation. Depuis jusqu'à 15% des coeurs peut rester dans le surnageant en raison de la viscosité élevée de RNAlater, les récupérer comme décrit dans l'étape 3.7.
- Sous une hotte chimique, ajouter 0,5 ml Trizol au tube contenant les cœurs sédimentées et garder sur la glace.
- Sous la microsco fluorescentepe, transférer le cœur (de l'étape 3.5) de la coupelle d'agarose revêtues 1% contenant la solution de FBS RNAlater / L-15/10% dans un autre plat d'agarose revêtues 1% avec 3 ml de L-15/10% de FBS à diluer le RNAlater. Recueillir les coeurs dans le centre de la boîte de Pétri et les transférer dans un petit volume dans le tube de coeurs sédimentées dans Trizol sous une hotte chimique.
- Vortex le tube de 1,5 ml contenant les cœurs Trizol perturber les cœurs et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Sous une hotte chimique, ajouter 100 pi de chloroforme (ATTENTION), mélanger soigneusement et transférer la solution / chloroforme Trizol dans un tube de 1,5 ml pré-filé PLG (centrifugeuse 30 secondes à la vitesse maximale avant utilisation). Incuber pendant 3 min à la température ambiante.
REMARQUE: Lire la FS de chloroforme avant utilisation. Poignée réactif de chloroforme sous une hotte et l'usure sur l'équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et les vêtements. Tenir à l'écart des matières incompatibles telles que les métaux, les alcalis. - Centrifuge de l'échantillon à 15 700 xg pendant 15 min à 4 ° C et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 5-10 ug glycogène et 250 pi préalablement refroidis (à -20 ° C) isopropanol; bien mélanger et incuber pendant la nuit à -20 ° C.
- Centrifuger l'échantillon à 15 700 g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Laver le culot avec 1 ml 75% d'éthanol, centrifuger à 15 700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Laisser évaporer l'éthanol par séchage de la pastille à la température ambiante jusqu'à ce qu'il devienne blanc (par exemple, pour 10 à 15 min).
- Ajouter 20 ul de RNase-free ddH 2 O au culot et incuber pendant 10-15 min à 55 ° C pour dissoudre l'ARN; puis garder sur la glace.
- Évaluer la concentration d'ARN et la pureté par mesure d'absorbance. Évaluer l'intégrité de l'ARN par l'exécution de l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%.
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Representative Results
Ici, nous décrivons une expérience coeur de dissection représentant utilisant le poisson zèbre Tg (myl7: GFP) twu34 lignée transgénique neuf, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) exclusivement dans le myocarde (Fig 1.). Nous avons recueilli les deux les cœurs disséqués et les embryons à partir de laquelle ils ont été dérivés pour évaluer la pureté de l'échantillon de coeur. Brièvement, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 poisson zèbre 9 ont été par croisement avec le type sauvage de sorte que tous les cœurs embryonnaires ont été étiquetés GFP. Quelques 56 500 embryons (HPF) ont été transférés dans des tubes de 1,5 ml (env. 100 embryons dans chaque) (Fig. 1A1, 1B). Chaque tube a été traité comme décrit dans la section de protocole (étape 2) et sur la figure 1A. Coeurs ont été libérés par aspiration et à plusieurs reprises (Fig. 1A2) puis appliqués sur un filtre de 100 um (Fig. 1A3). De gros morceaux de tissu embryonnaire ont été retenus dans ce filtre; cette fraction a été récupérée et mise en Trizol foextraction de l'ARN r pour obtenir un «embryon sans coeur" ARN échantillon (Fig. 1A3). Le accréditives contenant cœur a ensuite été appliqué sur un filtre de 30 um (Fig. 1A4), qui a conservé le cœur et les tissus des débris de taille similaire. cœurs positives pour la GFP ont été évacués du filtre dans une boîte de Pétri d'agarose revêtues (Fig. 1A5, 1C), rapidement recueillis dans le milieu de la cuvette sous un microscope stéréoscopique fluorescent et transféré dans 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). Dans ce tube avec RNAlater, nous avons regroupé les cœurs provenant de cinq tours de dissection (env. 300 coeurs de 500 embryons représentant une efficacité d'extraction d'environ 60%). Une comparaison des échantillons de coeur avant le tri des débris à partir d'embryons à 56 HPF (Fig. 1C) par rapport à 36 HPF (Fig. 1C) est représentée sur la figure 1. A 56 HPF, la perturbation des embryons a abouti à débris plus embryonnaire ( tels que des lentilles, Arrowhead, Fig. 1C) qu'à 36 hpf la suite de la filtration de l'étape 30 um (Fig. 1C).
Pour déterminer la pureté du 56 hpf échantillon «cœur», nous avons comparé les niveaux d'expression de transcriptions cardiaque par rapport extra-cardiaques de «cœur» et «embryon sans coeur" échantillons par RT-qPCR. À cette fin, nous avons extrait l'ARNm à partir de ces deux échantillons et évalué la qualité de l'ARN sur un gel d'agarose (figure 2A) et la quantité par mesure de l'absorbance (tableau 1) comme décrit dans la section de protocole (étape 3). La env. 300 cœurs ont donné 660 ng d'ARN. Ensuite, l'ADNc a été synthétisé en utilisant M-MLV transcriptase inverse RNase H (-) et des hexamères aléatoires selon les instructions de fabricant, et des expériences de RT-qPCR ont été effectués comme décrit 12. Les niveaux d'expression des gènes relatifs ont été calculés pour des marqueurs spécifiques de tissus différents, tels que polypeptide à chaîne légère de myosine 7 [myl7, un marqueur infarctus] 9, la kinase récepteur du domaine d'insertion comme [kdrl, un / marqueur endocardiaque endothéliale] 13, de l'hémoglobine bêta embryonnaire-1.1 [hbbe1.1, un marqueur d'érythrocytes] 14-alpha cristalline A [cryaa, un marqueur de lentille oculaire] 15, et la protéine gliale fibrillaire acide [GFAP, un marqueur du système nerveux central] 16 (figure 2B). Le facteur eucaryote d'initiation de traduction poisson zèbre 1B [eif1b] 12 a été utilisé comme un gène de référence interne (voir le tableau 2 pour les numéros d'identité, GenBank séquences d'amorces, la taille des produits de PCR et spécificité tissulaire pour chaque gène). Comme prévu, myl7 a été fortement enrichi dans l'échantillon "de coeur" par rapport à la «embryon sans coeur" échantillon (Fig. 2B). Le marqueur de cellule endothéliale kdrl a été jugée modérément enrichi dans l'échantillon de cœur, comme prévu (environ 40% des cellules cardiaques à 56 HPF sont kdrl dites-vous cellules endocardiques) (Fig. 2B). Le hbbe1.1 marqueur érythrocytaire a été surreprésentés dans l'échantillon «cœur», même si les cœurs étaient stmauvais battement après dissection, ce qui devrait exclure les globules rouges du coeur (Fig. 2B). En revanche, les niveaux de la CNS et des marqueurs de l'objectif (de la GFAP et cryaa, respectivement) expression étaient extrêmement faibles dans le "coeur" échantillon (Fig. 2B). Au total, nous concluons que les rendements de protocole coeur de dissection de haute qualité et de l'ARN spécifiquement cardiaque de entiers embryons de poisson zèbre.
Figure 1. extraction de coeur à partir d'embryons de poisson zèbre. (A) Schéma illustrant la procédure d'extraction de coeur. Environ 100 embryons vivants sont collectés dans un tube de 1,5 ml (A1, B, B '), anesthésiés puis pipette de haut en bas plusieurs fois à travers un embout de pipette étroite pour libérer les cœurs (A2). La solution résultante contenant les tissus embryonnaires (A2) est ensuite appliqué sur un filtre de 100 pm (A3). Tissus embryonnaires sans jaune et heArts et les gros débris embryonnaire restent dans le filtre (A3). L'écoulement continu est recueillie dans un tube de 50 ml (A3), puis appliqué sur un filtre de 30 um (A4). Les coeurs et les petits débris sont retenus dans le filtre de 30 um et transférés dans une petite boîte de Pétri d'agarose revêtues (A5, C, C '). EGFP coeurs marqués (C, C '; flèche) sont triés manuellement à partir du débris restants, tels que des lentilles (C, tête de flèche), et sont collectées dans le RNAlater (A6). Cette procédure est répétée au moins cinq fois et tous les cœurs sont mises en commun pour un traitement ultérieur. (BC) Superposition de la fluorescence (EGFP en vert) et DIC images de direct Tg transgénique (de myl7: EGFP) twu34 embryons à 56 HPF (B, C) et 36 HPF (B ', C') à deux pas du cœur procédure de dissection: avant dissection embryon (B, B ') et juste après le rinçage du filtre de 30 um, avant le tri des cœurs de débris dans la boîte de Pétri (C, C'). Barre d'échelle: 500 um.
Figure 2. Analyse de la qualité de l'ARN et la pureté par électrophorèse et RT-qPCR, respectivement. (A) ARN total à partir de l'échantillon «cœur» (2 ul) et de la "embryon sans coeur" échantillon (1 ul), dérivé de la 56 embryons HPF, résolus sur un gel agarose à 1%. De grandes bandes S18 et S28 ARNr indiquent que les ARN ne sont pas dégradées. Les taux d'expression relative des marqueurs spécifiques de tissus myl7 (myocarde), kdrl (endothélium), de hbbe1.1 (d'érythrocytes), cryaa (lentille) et GFAP (CNS) tel que déterminé par RT-PCR quantitative pour l'échantillon "de cœur" (B) normalisée à la «embryon sans coeur" échantillon. Les expériences de RT-qPCR ont été réalisées comme triplicatas techniques et les données sont présentées en tant que moyen ± SEM. Une analyse du test t non apparié a été effectuée. **** P <0,0001; ** P <0.005. pb, paire base.
| ID d'échantillon | ng / pl | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | curseur abs. | 340 premières |
| cœurs | 32,97 | 0,82 | 0,41 | 2.01 | 0,35 | 2,355 | 0,031 |
| embryons sans cœur | 568,82 | 14,22 | 7,00 | 2,03 | 2,04 | 6,965 | 0,018 |
Tableau 1. quantité d'ARN et de la qualité par mesure spectrophotométrique. La quantité et la qualité de l'ARN du «cœur» et «embryon sans le coeur" des échantillons provenant de 56 hpf embryons telle que mesurée par spectrophotométrie.
| geNE | GenBank # | séquence d'amorce | PCR taille du produit (pb) | Marqueur spécifique des tissus |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | myocarde |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endothélium / endocarde |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | système nerveux central |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | cristallin | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | érythrocyte |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | gène de référence |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tableau 2. Amorces utilisées pour les expériences de RT-qPCR. Nom, numéro d'accès GenBank, la séquence, la taille des produits de PCR et spécificité tissulaire sont présentés pour tous les gènes analysés.
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Discussion
Ce protocole permet l'enrichissement rapide de poisson zèbre tissu cardiaque embryonnaire pour l'expression génique analyse. La quantité et la qualité de l'échantillon d'ARN spécifiquement cardiaque dépend grandement sur quelques étapes cruciales: d'abord, la quantité de l'échantillon est grandement améliorée si la perte de coeurs est empêché à chaque étape du protocole, car la purification de l'ARN ne fonctionnera qu'avec suffisante matière de départ. D'autre part, la pureté de l'échantillon, qui dépend entièrement de l'expérimentateur, est déterminé par le tri et la collecte à l'intérieur de cœurs la boîte de Pétri en excluant rigoureusement autres tissus. En troisième lieu, la qualité de l'échantillon dépend essentiellement de limiter la dégradation de l'ARN qui peuvent se produire lors de la rupture des embryons; ceci est réalisé en utilisant un milieu de culture cellulaire afin d'éviter la mort cellulaire et en maintenant les échantillons sur de la glace. dégradation de l'ARN est arrêtée dès que les cœurs ont été transférés dans RNAlater ou Trizol. Ce cœurs battent dans la boîte de Pétri démontre puissamment que le t cardiaquequestion est physiologiquement normal après dissection.
Nous recommandons de commencer avec au moins 300 cœurs (soit environ 500 embryons), à partir duquel assez ARN peut être précipité en toute sécurité (avec 5-10 ug glycogène). Cependant, nous ne pouvons pas exclure que moins de coeurs suffiraient pour des expériences à petite échelle. Il est simplement important d'avoir suffisamment d'ARN pour déterminer la concentration, la pureté et l'intégrité de l'échantillon. Se il vous plaît, notez que le contenu ARN peuvent varier en fonction du stade de développement et sur le fond génétique de l'embryon (par exemple dans le cas des mutants avec des coeurs anormaux). Par conséquent, la quantité minimale d'embryons nécessaires pour une expérience devra être déterminée dans chaque cas particulier.
Il ya peu de différences techniques entre ce protocole et d'un protocole plus tôt par Burns et MacRae, et nous ne pensons pas qu'il y ait une différence significative de l'efficacité ou de la vitesse entre les deux protocoles.Cependant, nous avons apporté des améliorations: Plus important encore, nous suggérons l'utilisation de la solution de stabilisation RNAlater. Ce est important pour deux raisons: premièrement, pour recueillir l'ARN de haute qualité pour d'autres expériences telles que RT-qPCR en réduisant la dégradation des ARN à un minimum, comme RNAlater inactive immédiatement RNases et stabilise l'ARN dans les tissus ou de cellules. Deuxièmement, RNAlater est crucial pour permettre la collecte de coeurs sur des jours différents, ce qui est important lorsque le nombre d'embryons est un facteur limitant. Il permet également la mise en commun des cœurs qui peuvent être nécessaires pour obtenir une quantité suffisante de matière de départ pour l'isolement de l'ARN efficace de haute qualité avec Trizol. Transfert des coeurs directement dans Trizol permettrait de contourner l'utilisation de RNAlater, cependant, en raison de risques pour la santé, cette étape devrait être effectuée sous une hotte chimique, qui ne peut être supposé être situé dans le voisinage immédiat de la microscope à fluorescence pour tous les expérimentateurs .
Nous avons trouvé tchapeau la dissection de coeur fonctionne bien avec des embryons entre 20-72 HPF [12; données non publiées pour 72 HPF]. Cependant, la procédure d'extraction devient plus difficile avec l'âge embryonnaire et longueur: pipetage supplémentaires et plus énergique est nécessaire pour introduire avec succès des embryons dans la longue pointe et de séparer les cœurs d'autres tissus embryonnaires. En conséquence, les débris plus embryonnaire, est présente dans la préparation de l'échantillon (voir la figure 1C, C ') et l'expérimentateur doit être plus prudent à trier les coeurs dans la boîte de Pétri.
Le protocole coeur de dissection présenté ici permet une analyse de l'ensemble du profil d'expression cardiaque de différents types de cellules, y compris myocarde et l'endocarde. En outre la séparation des types de cellules cardiaques pourrait être réalisé en utilisant des lignes et l'infarctus du endocardial--reporteurs spécifiques [par exemple Tg (myl7: GFP) twu34 et Tg (kdrl: mCherry est de5] 9, 17 pour l'extraction de coeur combinée avec tri FACS. Contrairement à la méthode 18,19 Traduction ribosome Purification (TRAP), qui permet une analyse de transcriptionnelle tissu spécifique sans dissection de tissus, notre approche ne est pas limitée aux ARNm activement traduits, mais comprend également ARNm non-activement traduites ou ARN non codantes. Une autre application du protocole coeur de dissection est d'analyser l'expression des protéines à l'intérieur de cœurs: les taux de protéine peuvent être évaluées par buvardage de Western et la localisation de protéines peuvent être analysées par immunohistochimie, comme l'anatomie du cœur est conservée pendant la procédure de dissection.
En résumé, nous présentons ici un protocole détaillé pour disséquer coeurs fonctionnels / battant de centaines d'embryons dans un court laps de temps, qui peuvent être utilisés pour obtenir spécifiques cardiaques ARN (ou protéines) des échantillons de haute pureté pour des analyses ultérieures.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
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