Introduction
Liposomen zijn intensief onderzocht en dienen als een van de meest biocompatibele biomedische geneesmiddelafgiftesystemen voor klinische toepassingen 1,2. Zij bestaan hoofdzakelijk uit fosfolipiden en cholesterol, die beide biocompatibele verbindingen nabootsen delen van natuurlijke celmembranen. Overwegende dat hydrofiele stoffen kunnen worden ingesloten in de waterige interieur, kan lipofiele agenten binnen het liposomaal fosfolipidedubbellaag 3 worden opgenomen. Inkapseling van stoffen in het waterige inwendige van liposomen bescherming biedt tegen afbraak in vivo en voorkomt ook het hostsysteem van toxische effecten van chemotherapie voor de behandeling van ziekten, bijvoorbeeld chemotherapeutica gericht op het vernietigen van tumorcellen. De wijziging van de liposoomoppervlakte met polymeren zoals polyethyleenglycol (PEGylering) verdere uitbreiding van de liposomaal bloedcirculatie tijd in vivo vanwege sterische stabilisatie 4. Moreoveh, liposomen kunnen afzonderen hoge concentraties van verschillende stoffen zoals eiwitten 5,6, hydrofiele stoffen 7,8 en enzymen 9. Ze dienen dan ook als betrouwbare klinische therapeutische en diagnostische instrumenten die hun goedkeuring voor de levering van cytotoxische geneesmiddelen verdienen, zoals doxorubicine voor kankertherapie 4. Door hun flexibiliteit kunnen liposomen worden geladen met fluorochromen voor diagnostische en beeldgeleide chirurgische doeleinden.
Fluorescentiebeeldvorming levert een rendabele en niet-invasief in vivo diagnostisch hulpmiddel vereist echter een aantal fundamentele eisen. Het kan worden aangetoond dat fluorchromen die het best voor in vivo beeldvorming past hebben karakteristieke absorptie en emissie maxima in het bereik waar het licht dispersie en verstrooiing evenals weefsel autofluorescence afkomstig van water en hemoglobine is laag. Aldus dergelijke probes hun abs / em maxima tussen 650 en 900 nm 10. Daarnaast, de stabiliteit van de fluorochromen zowel in vitro en in vivo is kritisch, aangezien opsonisatie en snelle klaring sterk kunnen beperken hun toepassing in vivo beeldvorming 11. Andere effecten, zoals slechte stabiliteit en een lage gevoeligheid of cytotoxische effecten op doelorganen zoals gezien met indocyaninegroen (ICG) 12-16, zijn ongewenst en moet in aanmerking worden genomen bij het ontwerpen van sondes voor in vivo beeldvorming. Deze waarnemingen hebben geleid tot de actieve ontwikkeling van verschillende preklinische NIR fluorochromen, nanodeeltjes en nieuwe technieken voor de in vivo beeldvorming van ontstekingsprocessen, kanker en voor beeldgeleide chirurgie 17-20. Ondanks de stabiliteit van de meeste preklinische NIRF (nabij-infrarood fluorescentie) kleurstoffen in vitro, hun snelle perfusie en klaring door de lever en nieren belemmeren het gebruik bij de in vivo optische beeldvorming van ziekten en ontstekingsprocessen.
ntent "> We hebben daarom presenteren een protocol voor het inkapselen van fluorochromen zoals het goed gekarakteriseerd nabij-infrarood fluorescerende kleurstof DY-676-COOH, bekend om zijn neiging tot zelf-demping bij relatief hoge concentraties 21 in liposomen. Bij hoge concentraties H- dimeervorming en / of pi stapelen interacties tussen fluorofoor moleculen zich binnen elkaars Förster straal resultaat Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen het fluorochroom moleculen. Bij lage concentraties de ruimte tussen de fluorofoor moleculen toeneemt, waardoor-pi stapelen wisselwerking voorkomen en H-dimeervorming en resulteert in een hoge fluorescentie-emissie. De schakelaar tussen hoge en lage concentratie en de bijbehorende fluorescentiedoving en activering is een veelbelovende strategie die kan worden benut voor optische beeldvorming 22. Hierbij inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof NIRF DY-676-COOH in het waterige inwendige van liposomen is favorable voor in vivo beeldvorming dan de vrije kleurstof. De uitdaging van de werkwijze ligt allereerst in de juiste inkapseling en anderzijds in de validering van de voordelen van het inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof. Vergelijking van de beeldvormende eigenschappen van liposomen geblust met die van de vrije kleurstof en ook een niet afgeschrikt liposoomformulering met lage concentraties van de kleurstof onontbeerlijk. We tonen door een eenvoudige maar zeer effectieve film hydratatie en extrusie protocol gecombineerd met afwisselend bevriezen en ontdooien cycli die inkapseling van uitdoving concentraties DY-676-COOH in liposomen haalbaar. Andere methoden voor het bereiden van liposomen zoals de omgekeerde fase verdamping werkwijze 23 en de ethanol injectiemethode 24 staat liposoompreparaat hoge efficiënties van inkapseling voor veel hydrofiele stoffen. De aard van de stof te kapselen kan de inkapseling efficiëntie beïnvloeden. In effect,de film hydratatie en extrusie-protocol hier gepresenteerde onthulde het hoogste rendement voor het inkapselen van DY-676-COOH. Om de voordelen van liposomale inkapseling van DY-676-COOH, een zymosan geïnduceerde oedeem model, dat de studie van ontstekingsprocessen binnen enkele uren laat illustreren, werd gebruikt. Hier wordt aangetoond dat liposomen met een hoge concentratie van het ingekapselde DY-676-COOH zijn meer geschikt voor het gehele lichaam in vivo optische beeldvorming van ontstekingsprocessen dan de vrije kleurstof of niet- afgeschrikt liposomale formulering met lage concentraties kleurstof. Dus de onderliggende protocol een eenvoudige en snelle methode om geblust fluorescerende liposomen en de validatie van de activering en imaging potentieel zowel in vitro als in vivo produceren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures zijn goedgekeurd door de regionale dier commissie en in overeenstemming met internationale richtlijnen over de ethische gebruik van dieren.
1. Voorbereiding van de materialen en instrumenten
- Bereiding van spontaan gevormde vesicle dispersie (SFV)
- Los en worden voorraadoplossingen van de volgende fosfolipiden: 214 mg / ml ei fosfatidylcholine (EPC), 134 mg / ml cholesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanolamine- N - [methoxy (polyethyleen glycol) -2000] (ammoniumzout) (mPEG 2.000 -DSPE) en 2 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (ammoniumzout) (NBD-DOPE) in chloroform en winkel in glazen flesjes.
- Furnish ongeveer 3 ml chloroform in een rondbodemkolf en breng de juiste hoeveelheid fosfolipide stockoplossing in de rondbodemkolf liposomen samengesteld EP voorbereidenC: Chol: mPEG 2.000 -DSPE bij een molaire verhouding van 6,5: 3: 0.5. Voor dubbele fluorescentie etikettering van liposomen toe 0,3 mol% NBD-DOPE aan de lipide-oplossing.
- Damp het chloroform uit de organische fosfolipide-oplossing onder verminderde druk (300 mbar) bij 55 ° C met een rotatieverdamper.
- Na een homogene fosfolipide film wordt gevormd, het verminderen van de druk tot 10 mbar voor 1-2 uur om de resterende chloroform storting te verwijderen.
- Terwijl de chloroform verdampt, ontbinden DY-676-COOH (6,181 uM) in 10 mM Tris buffer pH 7,4 en vul een Dewar vat met vloeibare stikstof. Schakel een ultrasoon bad en op 50 ° C.
- Breng een geschikt volume (0.5-1 ml) van DY-676-COOH (6,181 uM) oplossing aan de rondbodemkolf tot de droge film fosfolipide en vortex krachtig tot een spontaan gevormd blaasje (SFV) dispersie vormen hydrateren. Zorg ervoor dat alle van de fosfolipiden zijn verspreid om lipide verlies te voorkomen.
- Zorgvuldig transfer de rondbodemkolf die de SFV dispersie in vloeibare stikstof te bevriezen en de dispersie gedurende 3-5 min. Plaats de rondbodemkolf in een ultrasoon bad bij 50 ° C om de dispersie ontdooien dan vortex de dispersie krachtig gedurende 1-2 min. Herhaal dit zes keer, dus in totaal zeven vries en dooi cycli.
- Extrusie van SFV homogene liposoomvesikels vormen
- Breng de SFV dispersie in een 1 ml spuit (spuit-a) en extrusie van de dispersie door een 100 nm polycarbonaatmembraan met een LiposoFast Basic extruder in de injectiespuit-b.
- Extrusie van de dispersie van de spuit-b, terug in de spuit-een, en herhaal de cyclus tien keer. Door extrusie, de oplossing in de injectiespuit verandert van een wazige verschijning aan een heldere dispersie tijd. Na tien cycli (twintig enkele extrusie stappen) op te zuigen-b van het apparaat en extrusie van de dispersie voor de laatste keer uit de spuit-a direct in een steriele1,5 ml reactie buis.
- Zuivering van liposomaal ingekapseld DY-676-COOH van vrije kleurstof
- Bereid een gel chromatografiekolom met G25 kralen gedrenkt in 10 mM Tris buffer pH 7,4 (kolomlengte 28 cm, diameter 0.8 cm).
- Transfer 0,5 ml van geëxtrudeerd blaasje dispersie op de gel bed en laat het monster drain in de gel matrix.
- Elueer de liposomen met 10 mM Tris buffer pH 7,4 (Figuur 1A) en spoel de kolom totdat de vrije kleurstof drains volledig uit de kolom. Indien nodig, te verzamelen en recyclen van de vrije kleurstof door ontzouten en uitdroging volgens de instructies van de fabrikant.
- Concentreer de geëlueerde liposomen door ultracentrifugatie (200.000 xg, 2 uur bij 8 ° C) daarna dispergeren ze in voldoende hoeveelheid steriele 10 mM Tris buffer pH 7,4.
- Kwantificering van ingekapselde DY-676-COOH concentratie
- Maak een ijklijn door het oplossen van DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in 10 mM Tris buffer, pH 7,4 die 0,1% Triton X100.
- Los 2 ui (100 nmol uiteindelijke lipide van 50 mmol / l voorraad) van de liposomen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in 100 pl Tris-buffer die 1% Triton X100 de vesicles vernietigen en laat de ingekapselde kleurstof. Verdun monsters met 10 mM Tris buffer, pH 7,4 tot een uiteindelijke Triton-X100-concentratie van 0,1% (v / v) tot een totaal volume van 1 ml. Bereid alle monsters in duplo.
- Meet de absorptie en emissie van alle monsters (gratis dy-676-COOH en Triton-X100 behandeld liposomen) bij een excitatie λ = 645 nm en een emissie λ = 700 nm. Opzetten en gebruik een ijkkromme van de vrije kleurstof concentratie van ingekapselde kleurstof te bepalen.
- Liposoom karakterisering
- Bepaal de grootte en de zeta potentiaal van liposomen door dynamische lichtverstrooiing. Verdun het liposomale monsters met filter gesteriliseerd (0,2 um) 10 mM Tris buffer pH 7,4 tot aconcentration van 100-300 pM (lipide). Breng de verdunde monsters in een laag volume wegwerp cuvet en volgens de instructies van de fabrikant van het meten van de sample.
- Karakteriseren van de liposomen door elektronenmicroscopie de grootte, integriteit en homogeniteit van liposomaal vesicles staven volgens standaardprotocollen.
2. Validatie van fluorescentie-harden en Activering van Prepared Liposomen
- Fysisch-chemische analyse van fluorescentiedoving en activering
- Bereid twee 1,5 ml buizen voor de Lip-Q en 2 buizen voor de gratis DY-676-COOH. Breng 100 nmol totale lipiden (2,38 pl van een 42 mmol / l Lip-Q voorraadoplossing, bevattende 138 ug / ml van de ingekapselde DY-676-COOH) in de overeenkomstige buizen. Transfer gratis DY-676-COOH gelijk aan de kleurstof inhoud van Lip-Q (0,38 ug wat resulteert bijvoorbeeld van 138 ug / 1000 ul x 2.38 pi Lip-Q gebruikt). Incubeer een bade van elke probe bij 4 ° C en vries de tweede buis bij -80 ° C gedurende de nacht (16 uur).
- Verwarm een verwarmingsblok bij 30 ° C. Vul een koelbox met ijs en equilibreren een hoeveelheid van 10 mM Tris buffer pH 7,4 bij kamertemperatuur.
- Verwijder de probes uit 4 ° C en equilibreren bij kamertemperatuur (verpakt in aluminiumfolie bescherming tegen licht) snel ontdooien probes van -80 ° C bij 30 ° C gedurende 5 min. Chill de ontdooide sondes op ijs gedurende 1 minuut voor het overzetten naar kamertemperatuur (ook gewikkeld in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht).
- Voeg 10 mM Tris buffer (pH 7,4) aan elk van de probes tot 100 ui eindvolume en equilibreren alle probes bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Pipetteer 80 pi van elke sonde in een laag volume glazen cuvet en meet de absorptie van elke sonde 400-900 nm op een spectrometer. Zet de probe hun overeenkomstige buizen.
- Breng 80 ul van elke probe in een geschikte glazen cuveten meet het fluorescentie-emissie op een spectrofluorometer prikkelen de probes bij 674 nm en meting van de fluorescentie 694-800 nm.
- Cellulaire opname en fluorescentie activering
- Verkrijg en cultuur de volgende cellijnen in hun corresponderende kweekmedia volgens standaardomstandigheden (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtige atmosfeer). Hier gebruikt de murine macrofaag cellijn J774A.1 (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal kalfsserum), de humane glioblastoma cellijn, U-118 mg (MEM met essentiële vitaminen en 10% (v / v) foetaal kalf serum) en het menselijk fibrosarcoma cellijn, HT-1080 (RPMI met 5% FCS).
- Coat 8 putjes kamer objectglaasjes met poly-L-lysine (voeg 100 ul 0,001% poly-L-lysine aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. Zuig oplossing en laat de kamer objectglaasjes drogen tenminste 4 uur bij RT op een steriele werkbank. de kamer slides Spoel 3keer met 200 ul Hank's gebufferde zoutoplossing vervolgens verzegeld met paraffine en aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C tot nodig.
- Terwijl de kamer glaasjes drogen, filter-steriliseer de liposomen en kleurstofoplossing en bewaar bij 4 ° C tot nodig.
- Voor opname probe analyse met het hele lichaam in vivo NIR fluorescentie imaging systeem, bereid 5 kleine kolven voor elk van de 3 proef cellijnen (15 kolven in totaal). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg en HT-1080 cellen per kolf met 5 ml van de respectievelijke kweekmedium (in quintuples) en kweken gedurende 16-24 uur. Parallel aan de cultuur flacons, respectievelijk zaad 30.000 cellen van elke cellijn (J774A.1 en HT-1080) of 20.000 cellen (U-118 mg) tot 2 putjes van de kamer glijbaan en groeien in 500 ul kweekmedium voor 16-24 uur .
- Op de volgende dag, voeg 100 nmol (uiteindelijke lipide hoeveelheid) van Lip-Q tot 2 flesjes per cellijn en een goed van elke cellijn op de kamer dia.Onmiddellijk overdracht 1 kolf per cellijn tot 4 ° C en de tweede kolf terug naar de incubator.
Opmerking: Het volume van de probes aan de kolven toegevoegd en de kamer glijbanen zijn hetzelfde, waardoor de concentratie op kamer objectglaasjes 10-voudig hoger (5 ml wordt 500 pl cultuurmedium). Dit is noodzakelijk omdat microscopische detectie minder gevoelig zijn dan de NIR fluorescentie imaging systeem waarin celpellets uit de kolven worden afgebeeld. - Voeg de gratis DY-676-COOH in een concentratie gelijk aan de kleurstof inhoud van Lip-Q aan de cellen in 2 flesjes per cellijn en een goed van elke cellijn op de kamer dia, dan meteen overdragen 1 fles per cellijn tot 4 ° C (energiedepletie) en de andere kolf met de kamer schuif terug naar de incubator. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij de desbetreffende omstandigheden. De cellen in de kolf zonder probe dienen als onbehandelde controle.
- NIRF beeldvorming en semi-kwantitatieve analyse
- Na 24 uur incubatie tijd, oogst de cellen in kolven door wassen cellen 2x met Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) en vervolgens schrapen cellen in 500 pi HBSS en pellet door centrifugeren (5 min bij 200 xg) in 500 pl buizen.
- Plaats de buizen met de cel pellets (en HBSS) in een NIRF imager en beeld met behulp van filters voor excitatie (615-665 nm) en emissie (knippen in> 700 nm).
- Aftrekken autofluorescentie en de intensiteit van de doelgroep te evalueren versus autofluorescence volgens de instructies van de fabrikant. Hierdoor wordt de semi-kwantitatieve niveaus van fluorescentie-intensiteit als gemiddeld signaal (geschaald tellingen / sec), die meetellen zichten betekent na schaling belichtingstijd, camera gain, binning en bitdiepte, zodat de metingen vergelijkbaar onderling geven.
- Confocale microscopie
- Na 24 uur incubatie, de oogst van de cellen op de kamer dia's door het wassen van 2 maal met 500 pi HBSS.
- Bevestig de cells 200 pi HBSS dat 3,7% (v / v) formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl de fixatie aan de hand is, verdunnen het DNA vlek, Hoechst-33258 01:50 met montage-oplossing.
- Na fixatie, was de cellen 2 keer met HBSS dan scheiden de kamers van de glasplaatjes. Voeg 50 ul montage oplossing die het DNA-vlek op elke plek overeenkomt met de putjes van de kamer dia. Bedek de cellen met dekglaasjes, verzegelen randen met transparante nagellak en drogen aan de lucht gedurende 10 min bij kamertemperatuur (donker).
- Afbeelding cellen op een geschikte fluorescentie microscoop of confocale microscoop. Gebruik de volgende excitatie en emissie instellingen voor visualisatie van de overeenkomstige componenten: kernen (Hoechst-33258: excitatie 405 nm, emissie 420-480 nm). NBD-DOPE (liposoomlipide: excitatie 488 nm, emissie 530 nm). DY-676-COOH (NIR fluorescente kleurstof: excitatie 633-645 nm, emissie 650-700 nm).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de fluorescentie microscoop eenvailable is uitgerust met geschikte filters die excitatie en emissie golflengtes groter dan 630 nm mogelijk.
3. liposoom-gebaseerde In vivo fluorescentie beeldvorming van Ontsteking
- Voorbereiding van de dieren en materialen
- Huis 8-12 weken oude mannelijke NMRI muizen met een gewicht van ongeveer 36 g onder standaard omstandigheden met voedsel en water ad libitum.
- Zeven dagen voor de start van de experimenten geven alle muizen een lage feoforbide dieet om weefsel autofluorescentie te verminderen.
- Vierentwintig uur voorafgaand aan elk experiment scheren muizen het gewenste bereik (bijvoorbeeld hele rug gebied indien beeldvorming van achterpoot oedeem gewenst).
- Weeg de dieren en het berekenen van de hoeveelheid probe kg gewicht en gratis DY-676-COOH (gelijk aan worden geïnjecteerd per muis (Lip-Q en Lip-dQ bij 10 umol (lipide concentratie) per inhoud van Lip-Q gebruikte kleurstof) .
- Afbeelding van de dieren ineen hele lichaam NIR fluorescentie imager met dezelfde instellingen gebruikt voor de cel pellets. Deze meting geeft autofluorescentie van de dieren.
- Los 10 mg zymosan-A in 1 ml isotone zoutoplossing en bewaar overnacht bij 4 ° C.
- Inductie van ontsteking en in vivo beeldvorming NIRF
- Bereid 3 spuiten per muis met de volgende oplossingen. Vul een spuit met 50 ul zymosan-A oplossing (10 mg / ml) en de tweede spuit met 50 ul fysiologische zoutoplossing. Vul de derde spuit met de sondes, waarbij Lip-Q en Lip-dQ (10 umol / kg gewicht (lipiden)) zijn aangewezen voor proefdieren en gratis DY-676-COOH (concentratie als in Lip-Q) voor de controle dieren. Controleer de probes verdund met steriele HBSS 150 pl eindvolume.
- Solliciteer oogcrème op de ogen van de dieren tot droog te vermijden en verdoven van dieren met 2% isofluraan tot ze diep in slaap en reageren niet bij aanraking op de poten (Dit duurt ongeveer 2 min).
- Plaats de muis op een warme mat (nog onder narcose) en injecteer de zymosan-A oplossing subcutaan op de rechter achterpoot en de zoutoplossing op de linker achterpoot. Onmiddellijk injecteer de sonde intraveneus en het imago van het dier daarna vervolgens recordtijd van injectie / meting (als t = 0 uur). Sla de resulterende beelden zoals kubussen en herhaal de bovenstaande stappen voor alle andere dieren en de respectieve sondes.
- Afbeelding van de dieren om de 2 uur voor 10 uur na injectie en vervolgens 24 uur na de injectie, en zorg ervoor dat het stadium van de meetkamer is warm (bijvoorbeeld door het plaatsen van een warme mat eronder), om onderkoeling te voorkomen. Na elke meting, plaats de dieren in een kooi met voedsel en water ad libitum en plaats de kooi in een gematigd dier kamer. Euthanaseren van de dieren door de eerste verlamming met 2% isofluraan tot de dieren niet meer reageren op raken, dan euthanaseren met koolstofdioxide voor 5-10 min, waardoorzorgen dat de dieren volledig te stoppen met ademhalen en rigor mortis optreedt.
- Ontleden de muizen volgens standaardprotocollen die online kan worden beoordeeld (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) en het beeld van de organen.
- Evalueren van de meetresultaten volgens de instructies van de fabrikant door eerst aftrek van de totale fluorescentie van de dieren (ontmenging) dan het toewijzen van gebieden van belang voor autofluorescentie (linker achterpoot met zout) en target fluorescentie van ontstoken gebied (rechter achterpoot met zymosan-A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals de NIRF kleurstof DY676-COOH hier in het waterige inwendige van liposomen leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentraties, kunnen in verschillende in vivo imaging toepassingen waar een hoge gevoeligheid en betrouwbare detectie van het doelgebied zijn opgesteld worden benut. Het gebruik van liposomen ook bescherming van de kleurstof die onmisbaar is voor in vivo toepassingen. Een grondige karakterisatie van de liposomen noodzakelijk en omvat verschillende factoren zoals het niveau van kleurstof ingekapseld, stabiliteit en de grootte van de liposomen, fluorescentiedoving en de activiteit van ingekapselde kleurstof in vitro en ook toepasbaarheid in vivo imaging doeleinden. Een vergelijking van de vrije kleurstof, DY-676-COOH en geblust liposomen (Lip-Q) en een niet afgeschrikt liposoom (Lip-dQ) met zeer lage concentrantsoen van de ingekapselde kleurstof derhalve cruciaal vooral voor in vivo karakteriseringen.
Liposomen bereid door de film hydratatie en extrusie techniek opeenvolgende vries en dooi cycli voor extrusie bevatten resterende vrije kleurstofmoleculen die met succes kunnen worden gescheiden van de liposomen door de langere retentie in de gelfiltratie matrix, vergeleken met de liposomen die sneller elueren ( Figuur 1B). Afhankelijk van de mate van verdunning na gelfiltratie, optioneel ultracentrifugatie stap kan de concentratie van de liposomen zoals voorgesteld (figuur 1C). Gebaseerd op de absorptie en emissie eigenschappen van de ingekapselde kleurstof, de concentratie van ingekapselde kleurstof wordt bepaald met behulp van een ijkkromme van de vrije kleurstof (figuur 1D). Naast de concentratie van het ingekapselde kleurstof, is het belangrijk om de grootte en homogeniteit van de liposomen achterste bepaleneh voorbereiding. Zoals in figuur 1E, electronenmicroscoop van liposomen bereid met de onderliggende methode blijkt een grotendeels unilamellaire morfologie van de liposomale blaasjes, die intravesicular DY-676-COOH hetzij binnen het doven concentratiebereik (Lip-Q; 606-846 pM DY-676 ) of bij niet-uitgeblust kleurstof concentratie (Lip-dQ; 25 uM DY-676). Bovendien onthullen ze een homogene grootteverdeling van ongeveer 120 nm en polydispersiteit indices ver beneden 1 (Tabel 1). Door fluorescentie uitdoving, Lip-Q toont twee absorptiemaxima in waterige buffer, waarbij een piek wordt gekenmerkt door een verschuiving naar de blauwe golflengten. Overeenkomstig wordt de fluorescentie-emissie is veel lager dan de vrije kleurstof (figuur 2A en B, rechts). Freeze-beschadiging van de liposomen resulteert in afgifte van de kleurstof, die wordt verdund in het omringende oplossing. De-blauwe verschoven absorptie piek daarom disappears, resulterend in een enkele absorptiepiek van Lip-Q. In overeenstemming hiermee wordt een toename in fluorescentie-intensiteit van gevries- beschadigde Lip-Q gezien, wat aangeeft dat fluorescentie geactiveerd vrijgemaakte kleurstof moleculen plaats. De vrije kleurstof laat slechts één maximale absorptie en een hoge fluorescentie-intensiteit die blijven op hetzelfde niveau, ongeacht bevriezing (figuur 2A en B, links). Deze bevinding suggereert dat inkapseling van de kleurstof in liposomen, zoals in Lip-Q de kleurstof zou beschermen tegen de omgeving behouden hoge concentratie en de bijbehorende fluorescentiedoving en indien geactiveerd doel triggers zouden detectie door toename in fluorescentie mogelijk.
Liposomale probes met de onderliggende lipide samenstelling blijkt overwegend fagocytische opname die wordt geremd door energietekort. Dit kan via de opname van Lip-Q worden gezien door de zeer fagocyterende muizen macrofaagcellijn J774A.1, en delicht fagocytische humane glioblastoma cellijn U-118 mg bij 37 ° C en inhibitie bij 4 ° C (figuur 3A en B). De vrije kleurstof DY-676-COOH openbaart opname in de fagocytische cellijnen zowel bij 37 ° C en bij 4 ° C hetgeen aangeeft dat de liposomale probe Lip-Q bevat geen residuele vrije kleurstof in de oplossing en kan alleen ondergaan actieve opname. Confocale laser scanning microscopische beelden nader te onderbouwen van de opname en de activering van Lip-Q in fagocyterende cellen (Figuur 3C). Bovendien is het ontbreken van fluorescentie in de niet-fagocytaire menselijke fibrosarcoom cellijn HT-1080 geeft aan dat de opname van Lip-Q hoofdzakelijk door fagocytose en dus geschikt voor beeldvorming van ontsteking waarbij fagocytische monocyten / macrofagen betrokken zijn.
In overeenstemming met de fagocytische opname van liposomen waargenomen in gekweekte cellijnen en door fluorescentie quenching intraveneuze injectie van Lip-Q leidt tot een tijds-afhankelijke toename in fluorescentie-intensiteit van oedeem in muismodellen (Figuur 4A, Lip-Q), met zeer lage achtergrond fluorescentie. De maximale fluorescentie-intensiteit van oedeem wordt gedetecteerd 8-10 uur na injectie van Lip-Q. In tegenstelling, relatief sterke NIR-fluorescentie van de gehele muis waargenomen na toepassing van de vrije DY-676-COOH (Figuur 4A, DY-676-COOH) of altijd ingeschakelde liposoom Lip-dQ (Figuur 4A, Lip-dQ ). Vergeleken met Lip-Q snelle perfusie en klaring van vrij DY-676-COOH gezien 0-4 uur na injectie, interfereert met beeldvorming, zodat een betrouwbare detectie van oedeem niet mogelijk (Figuur 4A, DY-676-COOH ). Bovendien, de niet afgeschrikt liposoom Lip-dQ onthult een maximale fluorescentie van oedeem binnen 2-4 uur na injectie die vrijwel constant tot 8 uur blijft, daalt geleidelijk vergelijkbaar met het afgeschrikte Lip-Q-gebaseerde oedeem fluorescentie. Het uitvoeren van semi-kwantitatieve analeyses, waarbij gebieden van belang (ROI) vastgesteld voor oedeem versus achtergrond, kan men conclusies trekken over de verschillende detectie met verschillende probes maken. Volgens semi-kwantitatieve analyse van 5 dieren per groep (probe), kan oedeem meer significant (p = 0,001) gedetecteerd met Lip-Q dan de vrije DY-676-COOH of niet afgeschrikt, Lip-dQ (figuur zijn 4B).
Imaging organen van muizen gedood 24 uur na injectie van probes onthullen milde ex vivo fluorescentie van de lever / galblaas en de nieren en een zeer lage of geen fluorescentie van de milt, longen en hart (figuur 5), die dient als bewijs voor de eliminatie van de sondes door de lever en gal.
Figuur 1: Bereiding van DY-676-COOH geladen liposooms. (AC) Schematisch overzicht van de synthese stappen die betrokken zijn. (A) Instellen van de film hydratatie en extrusie met het nabij-infrarode kleurstof DY-676-COOH. (B) Foto van de self-made gelfiltratie- setup met de interfase tussen niet ingekapseld (gratis) kleurstof en liposomen. Liposomen elueren eerste en verschijnen blauw-groen als gevolg van de ingekapselde DY-676-COOH (blauw) en de ingebouwde groene fosfolipide, NBD-DOPE. (C) representatief beeld van liposoom-sediment (Lip-Q) na concentratie door ultracentrifuge. ( D) Vertegenwoordiger kalibratiecurve van DY-676-COOH in 10 mM Tris pH 7,4 (die 1% Triton X100) gebruikt voor de kwantificering van liposomaal kleurstof. (E) Cryo-transmissie electronen microscoop van Lip-Q. Klik hier om te bekijken een grotere versie van de figuur.
Figuur 2:. Fysicochemische bepaling van fluorescentie uitdoving en activatie in vitro (A) Absorptiespectra van Lip-Q (rechts) en vrij DY-676-COOH (links) gemeten in 10 mM Tris buffer pH 7,4, voor of na bevriezing bij - 80 ° C. Let op de karakteristieke dubbele piek van Lip-Q in vergelijking met gratis DY-676-COOH en het verdwijnen van de blauwe-verschoven piek na vorst-schade van Lip-Q. (B) Overeenkomstige fluorescentie-emissie spectra van Lip-Q (rechts) en vrij DY-676-COOH (links) gemeten in 10 mM Tris buffer pH 7,4 vóór of na het invriezen bij -80 ° C.
Figuur 3: Cellulaire opname en fluorescentie geactiveerd lip osomes. De beelden in (A) bereid door NIR fluorescentie beeldvorming van celpellets na blootstelling aan de overeenkomstige probes gedurende 24 uur bij de aangegeven temperaturen. De HT-1080 cellen niet de 24 uur incubatieperiode bij 4 ° C overleven. De staafdiagrammen in (B) geven de semi-kwantitatieve niveaus van fluorescentiesignalen kregen door het toewijzen ROI de celpellets in A. Elke staaf geeft het gemiddelde intensiteiten van n = 3 experimenten ± SD. Afbeeldingen in (C) werden verkregen door confocale laser scanning microscopie van cellen blootgesteld aan probes op kweekkamer objectglaasjes gedurende 24 uur bij 37 ° C. Let op het hoge niveau van de fluorescentie in de hoge fagocyterende muizen macrofaagcellijn J774A.1 en de gematigde fluorescentie in de milde fagocyterende menselijk glioblastoom cellijn U-118 mg. De niet-fagocyterende menselijk fibrosarcoma cellijn HT-1080 toont geen fluorescentie van de sondes. NBD-DOPE: green fluorescent fosfolipiden.belasting / 52136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 4. In vivo optische beeldvorming van zymosan geïnduceerde oedeem bij muizen. (A) De muis foto links toont de posities van subcutaan toegepast zymosan-A (500 ug in 50 pl zoutoplossing) en controle zoutoplossing (50 pl) op de linker flank. Intraveneuze injectie van de vermelde probes en het gehele lichaam NIR fluorescentie beeldvorming op de aangegeven tijdstippen onthullen geleidelijke maar sterke toename van fluorescentiesignalen van oedeem en lage achtergrondsignalen van Lip-Q (bovenste paneel) met een maximale fluorescentie op 8 uur na injectie. De gratis kleurstof onthult perfusie en snelle klaring binnen 4 uur na injectie (middelste paneell), terwijl Lip-dQ onthult detectie van oedeem met lage signaal intensiteiten en een algemene hogere achtergrond fluorescentie. De tekening in (B) herhalen waargenomen fluorescentiesignalen van oedeem gedetecteerd met elke probe vergeleken met het controlegebied (zoutoplossing) in n = 5 dieren per groep. Elke grafiek geeft de gemiddelde fluorescentie signalen (n = 5) ± SEM. Met de grafieken, de maximale fluorescentie signaal van oedeem gedetecteerd met elke sonde is gemakkelijk te onderscheiden (Lip-Q, 8 uur; Lip-dQ 2-4 uur en gratis DY-676-COOH, 2 uur na injectie). Er is een significant (p = 0,001) hogere fluorescentie-intensiteit van oedeem met Lip-Q versus Lip-dQ op t = 0-24 uur, en met Lip-Q versus vrije DY-676-COOH op t = 4-24 uur. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Bio-optische ex vivo beelden van organen van muizen 24 uur na sonde toepassing en bijbehorende semi-kwantitatieve analyse van de fluorescentie-intensiteiten van de organen. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde van fluorescentie-intensiteiten (n = 4) ± SEM. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
| Liposoomformulering | Grootte [nm] | Polydispersiteit index (PI) | Zeta-Potentiaal [mV] |
| Lip-dQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0,055 ± 0.02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (geblust) | 118,5 ± 0,7 | 0.04 ± 0.02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (w / o DY-676-COOH) | 123.0 ± 1.4 | 0.04 ± 0.03 | -11 ± 1 |
Tabel 1: Analyse van liposomen door dynamische lichtverstrooiing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien liposomen ook kan dienen als afgiftesystemen voor fluorescente kleurstoffen, zij stellen beeldvorming van doelziekten. Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals NIRF kleurstof, DY676-COOH hier gebruikt, leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving van de ingesloten kleurstof. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentratie kan in verschillende in vivo beeldvormende toepassingen, waarbij een hoge gevoeligheid en betrouwbare detectie van het doelgebied wordt geëist worden benut. Het gebruik van liposomen ook bescherming van de kleurstof die onmisbaar is voor in vivo toepassingen.
De film hydratatie en extrusie techniek is een veel gebruikte werkwijze die succesvol bereiden van liposomen met verschillende grootte varieert afhankelijk van de behoefte mogelijk en maakt modificaties zoals inkapseling van een veelvoud aan verschillende stoffen 25. Het is dus geschikt voor de bereiding van liposomes ingekapseld met de NIR fluorescente kleurstof, DY-676-COOH voor beeldvormingsdoeleinden. De werkwijze levert liposomen met 600-840 pM intravesicular kleurstof concentraties die binnen het afgeschrikte concentratie van de kleurstof. De LiposoFast-Basic handextruder voor de homogenisering van spontaan gevormde vesicle dispersie is geschikt voor liposoombereiding kleine labschaal, vanwege de verenigbaarheid van de inrichting, met spuiten maximaal 1 ml volume. Voor grootschalige bereidingen het gebruik van grotere hoge druk homogenisatoren die kunnen vesicle dispersies homogeniseren met een capaciteit van 1000 l per uur aanbevolen. De gelfiltratie (grootte-uitsluitingschromatografie) chromatografie is een cruciale stap die scheiding van de liposomale ingekapselde kleurstof van niet-ingekapselde (gratis) kleurstofmoleculen 26 verzekert. De lengte van de gelfiltratiekolom is essentieel voor efficiënte scheiding van de liposomen van vrije kleurstof. Het is dus noodzakelijk om een kolom met ten minste 28 cm lengte t voorbereideno succes de liposomen te scheiden van de vrije DY-676-COOH hier gebruikt. Interessant is dat deze lengte is twee keer zo lang als die wordt gebruikt om carboxyfluoresceïne (CF) geladen liposomen te zuiveren van vrije carboxyfluoresceïne. Het grote nadeel van gelfiltratie een 5-6-voudige verdunning van de gezuiverde monsters. Dit kan worden gecompenseerd door ultracentrifugatie, als sterk geconcentreerde liposomen nodig. Tijdens ultracentrifugeren de liposomen bezinken en de bovenstaande kan gemakkelijk 27 worden verwijderd. Andere manieren om liposomen te concentreren zoals door dialyse 28 meer tijd dan ultracentrifugatie.
Naast de film hydratatie en extrusie werkwijze, de omgekeerde fase verdamping werkwijze 23 en de ethanol injectiemethode 24 staat liposoompreparaat hoge inkapselingsefficiëntie vele hydrofiele stoffen. Echter, ons onderzoek bleek de film hydratatie combinatie met de vries en dooi cycluss de meest geschikte methode voor voldoende intraliposomaal inkapseling van DY-676-COOH zijn. Het verhogen van de start DY-676-COOH concentratieniveau film hydratatie verhoogt de werkzaamheid en de concentratie van de intraliposomale kleurstof, als in een vaste lipide concentratie van 30 mM wordt gebruikt. Ondanks de inkapseling efficiëntie van de vries en ontdooi werkwijze minder dan 10% van het uitgangsmateriaal kleurstof gebruikte concentratie, maar toch voldoende voor inkapseling van de quenching concentratie vereist voor beeldvorming. Bovendien kan het vrije kleurstof gescheiden van liposomen door gelfiltratie worden gerecycled door ontzouten en dehydratatie volgens de instructies van de fabrikant, waardoor opnieuw inkapseling mogelijk een algemeen minimaal verlies kleurstof. De inkapseling van de kleurstof door het onderliggende protocol heeft geen invloed op de grootte en morfologie van de liposomen zoals gezien door de polydispersiteit indexen en de elektronen microfoto van Lip-Q.
Verscheidene eenvoudige methoden kunnen worden gebruikt om evaluate de activiteit van bereide fluorescerende liposomes.DY-676-COOH heeft een sterke neiging tot zelf-demping bij hoge concentraties 21,29 waarschijnlijk als gevolg van H-dimeer vorming en-pi stapelen interacties tussen kleurstofmoleculen. Deze interacties, die als gevolg van de nabijheid van de Förster stralen van kleurstofmoleculen bij hoge concentraties voorkomen, kan worden vernietigd door verdunning 30. Daarom inkapselen van hoge concentraties DY-676-COOH niet alleen de kleurstof tegen opsonisatie in vivo, maar ook uit de omringende buffer, waardoor de hoge concentratie handhaven en behouden fluorescentiedoving die kunnen worden gedetecteerd als een blauw-absorptie verschoven piek en lage fluorescentie-emissie zoals weergegeven in figuur 2. Invriezen liposomen langzaam bij -80 ° C leidt tot de vorming van ijskristallen in het waterige inwendige 31 die schade liposomaal membraan veroorzaakt wanneer rashly ontdooid bij 30 ° C. De release, verdunning en fluorescentie activatie van de intra-liposomale DY-676-COOH in buffer na bevriezing geopenbaard in een enkele absorptiepiek bijna 2,5-voudige toename in fluorescentie-intensiteit (Figuur 2), wat aangeeft dat Lip-Q sequesters dus een hoog quenching concentratie DY-676-COOH en activeerbaar. Andere methoden om liposomale lipide bilaag schade zoals wasmiddelen of organische oplosmiddelen duidelijke verschillen tussen de vrije kleurstof en de liposomale ingekapselde kleurstof niet bekend, aangezien zij beiden beïnvloeden de spectrale eigenschappen van verschillende fluorescerende kleurstoffen 32. De langzaam invriezen en zware ontdooimethode hier dus vermeld dient als een betrouwbare en veelbelovende methode om de hoge inkapseling fluoroforen in liposomen en een daaruit fluorescentiedoving valideren. Van de absorptie- en emissiespectra van intacte Lip-Q (figuur 2), kan enige mate van residuele fluorescentie worden gedetecteerd. Dit kan resulteren uit niet- afgeschrikte kleurstof monomeren in de liposomes en ook van elektrostatische interactie en invloed van ingekapselde kleurstof door fosfolipiden polaire kopgroepen 33.
Zoals te zien in figuur 3, een duidelijke accumulatie van Lip-Q in het bijzonder murine macrofaag fagocytose en milde fagocytische humane glioblastoma cellijn U 118 mg-34, maar niet in de niet-fagocytaire menselijke fibrosarcoom cellijn HT-1080, wijst dat Lip-Q-gebaseerde beeldvorming van ontsteking gunstig zou zijn, omdat fagocyten zijn de belangrijkste spelers van ontstekingsprocessen. Dat energiedepletie afschaft opname van Lip-Q maar niet opname van vrij DY-676-COOH bevestigt de specificiteit van fagocytische opname van Lip-Q en onthult dat Lip-Q intact blijft tijdens het experiment, anders vrijgave van de kleurstof en energie-onafhankelijke opname zou plaatsvinden die leidt tot opsporing fluorescentie nemen. Inbedden van de green fluorescent fosfolipiden, NBD-DOPE in de liposoomdubbellaag maakt microscopische beeldvorming en discrimination tussen niet-gedegradeerd van cellulaire gedegradeerde liposomen vooral als tijdsafhankelijke opname experimenten worden uitgevoerd zoals eerder 32 beschreven. De microscopische beelden onthullen NIR fluorescentie van DY-676-COOH die correleert met de mate van fluorescentie-intensiteiten van celpellets, zoals vastgesteld met semi-kwantitatieve analyse na incubatie bij 37 ° C. In overeenstemming hiermee het murine macrofaag cellijnen vertonen de hoogste fluorescentie, terwijl de menselijke glioblastoma onthullen lagere fluorescentie van zowel DY-676-COOH en NBD-DOPE dan de eerste. Zoals verwacht het menselijk fibrosarcoma cellijn, HT-1080 tonen geen fluorescentie van een van beide liposomaal kleurstoffen of de vrije DY-676-COOH, waarbij het feit dat Lip-Q opname, is voornamelijk door fagocytose versterkt.
Om het potentieel van onderzoeken Lip-Q-gebaseerde fagocytose gedreven in vivo beeldvorming van ontsteking, werden verscheidene controles beschouwd. Omdat het vrije DY-676-COOH door phagocyt kan wordenosis kan opsonisatie van Lip-Q leidt tot vrijgave van de kleurstof, die door fagocyten kunnen worden. Om dit te voorkomen, werd Lip-Q bereid met 5 mol% PEGylering. Bovendien moet onderscheiden opname door ontsteking gebaseerde EPR effect en actieve opname en fluorescentie activatie. Om dit aan te pakken, de evaluatie en vergelijking van drie verschillende sondes, namelijk de always-on, Lip-dQ, de uitgeblust Lip-Q en de vrije DY-676-COOH in muizen met-zymosan geïnduceerde oedeem was noodzakelijk. Zymosan-A dat is bereid uit de celwanden van Saccharomyces cerevisiae en Candida albicans is een natuurlijke stimulant van cytokine secretie via dectin-1 en toll-like receptor 06/02 (TLR 06/02). Uitgescheiden cytokinen beurt induceren de activering van stroomafwaartse cascades die leiden tot vasculaire lekkage, waardoor de intravasation / extravasatie van monocyten / macrofagen verlichten van een milt reservoir 35 en neutrofielen en hun migratie naar ontsteking plaatsen(Oedeem) 36-39. De-zymosan gebaseerd monocyten / macrofagen extravasatie en migratie proces moet alleen 4,5-6 uur die zymosan een strategisch instrument voor het bestuderen van ontstekingsprocessen 36-39 maakt. Door de vasculaire lekkage die resulteren in ontsteking, intraveneus probes kunnen hetzij door monocyten / macrofagen (fagocyten) worden geregistreerd tijdens hun migratie naar de plaats van ontsteking of extravasaat en worden opgenomen op het oedeem plaats (EPR effect) 40. Het gebruik van de niet-afgeschrikte Lip-dQ onthult een algemeen sterkere achtergrond oedeem signalen dan Lip-Q, en een fluorescentie verhoging van oedeem die de migratie van monocyten en macrofagen weerspiegelt. In feite wordt de maximale fluorescentie van oedeem al gezien 2-4 uur na toepassing van Lip-dQ en blijft vrijwel constant tot 8 uur. Tegenover Lip-dQ en Lip-Q, de vrije DY-676-COOH ondergaat snelle perfusie na injectie en verwijdering binnen 4 uur, zodat verschillende beeldvorming van oedeem is niet mogelijk. Interestingly, het gebruik van Lip-Q blijvende toename in fluorescentie-intensiteit van oedeem en zeer lage achtergrond signalen. Deze aanhoudende stijging van de fluorescentie-intensiteiten met Lip-Q wordt toegeschreven aan de activering van de liposomaal vrijgegeven kleurstof fluorescentie. Samengevat kan worden geconcludeerd dat de bijdrage van EPR-effect Lip-Q gebaseerde beeldvorming is minimaal, aangezien Lip-dQ tonen een maximum fluorescentie (EPR effect en monocyten migratie) en 4 uur na injectie. Aldus liposomale inkapseling beschermt en afzonderlijke levering van DY-676-COOH, die op haar beurt een betrouwbaardere in vivo beeldvorming van oedeem, uitsluitend na internalisatie en degradatie (fluorescentie activering) door fagocytische cellen. Tot dusver het gebruik van zymosan geïnduceerde achterpoot oedeem aan de beeldvormende eigenschappen van fluorescerende liposomen valideren is nieuw. Het protocol dit formulier kan zowel worden uitgebreid door inkapseling van verschillende fluorescente kleurstoffen en door beeldvorming het effect van verschillende inhibitorische drugs op de inductie van ontsteking en is derhalve een nuttig instrument voor de bereiding en karakterisering van probes geschikt voor biomedische beeldvorming.
Een andere cruciale stap op weg naar het definiëren van geschikte probes voor medische beeldvorming is de verificatie van hun farmacologische eigenschappen en eliminatie routes. De verdeling van probes in organen waarin vitale rol spelen bij uitscheiding, zoals de lever en nieren alsook hun korte retentie en passende verwijdering van deze organen is gewoonlijk een aanwijzing, dat de sondes geen nadelige gevolgen voor de patiënt veel waarschijnlijk tonen. In overeenstemming hiermee de organen van muizen bereid 24 uur na injectie van Lip-Q of de vrije DY-676-COOH tonen slechts milde fluorescentie van de lever / galblaas en de nieren, een voorkeurs- eliminatie van de liposomale fluorofoor betekent door de lever en gal. Het korte verblijf van de sondes in deze organen en hun efficiënte eliminatie wordt onderbouwd door een 7-fold hogere fluorescentie signalen van organen voorbereid 6 uur na injectie van Lip-Q of de vrije DY-676-COOH 32. Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met de afschaffing van de liposomen 41 en back-up van het belang van het opnemen Biodistributiestudies bij het karakteriseren van sondes. Hoewel nadelige bijwerkingen, zoals huidirritaties en complementactivering 42,43 gerapporteerd voor liposomale formuleringen in klinische toepassingen worden dergelijke effecten niet gedetecteerd met de onderliggende liposomen. Bovendien observatie immuundeficiënte muizen twee weken na injectie probe tot goedkeuring van de probes uit de muizen zich aanvullen (niet getoond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft subsidies HI-698 / 10-1 en RU-1652 / 1-1. Wij danken Doreen mei voor uitstekende technische bijstand en het bedrijf DYOMICS GmbH, Jena voor hun vriendelijke steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
