Introduction
Les liposomes ont été intensivement étudiée et servir comme l'un des systèmes les plus biocompatibles de délivrance de médicaments pour des applications biomédicales cliniques 1,2. Ils sont principalement constitués de phospholipides et de cholestérol, qui sont tous deux composés biocompatibles imitant des parties de membranes cellulaires naturelles. Considérant que les substances hydrophiles peuvent être piégés dans l'intérieur aqueux, agents lipophiles peuvent être incorporés dans la bicouche liposomale trois phospholipides. L'encapsulation de substances dans l'intérieur aqueux des liposomes confère une protection contre la dégradation in vivo et empêche également le système hôte contre les effets toxiques des médicaments cytotoxiques utilisés pour la thérapie de maladies, par exemple des agents chimiothérapeutiques visant à détruire les cellules tumorales. La modification de la surface liposomique avec des polymères comme le polyethylene glycol (pégylation) se étend en outre le temps de circulation sanguine des liposomes in vivo en raison de la stabilisation stérique 4. Moreover, les liposomes peuvent séquestrer des concentrations élevées de plusieurs substances telles que les protéines, 5,6 substances hydrophiles 7,8 et 9 enzymes. Ils servent donc des outils thérapeutiques et diagnostiques cliniques fiables qui méritent leur approbation pour la livraison de médicaments cytotoxiques tels que la doxorubicine pour le traitement du cancer 4. En raison de leur souplesse, les liposomes peuvent également être chargées avec des fluorochromes à usage chirurgical et de diagnostic par imagerie.
imagerie de fluorescence fournit un coût-efficace et non invasive outil de diagnostic in vivo qui, cependant, exige certaines exigences de base. Il pourrait être démontré que fluorochromes qui conviennent le mieux pour l'imagerie in vivo ont absorption caractéristique et maxima d'émission dans la gamme où la dispersion de la lumière et de diffusion ainsi que autofluorescence de tissu provenant de l'eau et de l'hémoglobine est faible. Ainsi, de telles sondes ont leurs maxima abs / em entre 650 et 10 900 nm. En outre, la stabilité de fluorochromes la fois in vitro et in vivo est critique, opsonisation et le dédouanement rapide peuvent considérablement limiter leur application pour l'imagerie in vivo 11. D'autres effets tels que la mauvaise stabilité et une faible sensibilité ou des effets cytotoxiques sur les organes cibles comme on le voit avec le vert d'indocyanine (ICG) 12-16, sont indésirables et doivent être pris en considération lors de la conception des sondes pour l'imagerie in vivo. Ces observations ont conduit au développement actif de plusieurs fluorochromes NIR précliniques, des nanoparticules ainsi que de nouvelles techniques pour l'imagerie in vivo de processus inflammatoires, le cancer et pour la chirurgie guidée par l'image 17-20. En dépit de la stabilité de la plupart (fluorescence dans le proche infrarouge) NIRF colorants préclinique in vitro, leur perfusion rapide et de la clairance par le foie et les reins empêchent leur utilisation dans l'imagerie optique in vivo de maladies et de processus inflammatoires.
MÉNAGEMENT "> Nous présentons donc un protocole d'encapsulation de fluorochromes tels que le bien caractérisé proche infrarouge colorant fluorescent DY-676-COOH, connu pour sa tendance à l'auto-trempe à des concentrations relativement élevées 21 dans des liposomes. A des concentrations élevées H- la formation de dimères et / ou pi-empilement interactions entre les molécules de fluorophore situées dans la suite de rayon de Förster les uns des autres dans Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) entre les molécules de fluorochrome. A faible concentration de l'espace entre les molécules de fluorophore augmente, empêchant de ce fait l'interaction de pi-empilement et H-formation de dimères et aboutissant à forte émission de fluorescence. Le commutateur entre la concentration haute et basse et la fluorescence trempe accompagnement et l'activation est une stratégie prometteuse qui peut être exploitée pour l'imagerie optique 22. À cet égard, l'encapsulation de fortes concentrations du colorant NIRF DY-676-COOH dans l'intérieur aqueux de liposomes est plus favorable pour l'imagerie in vivo que le colorant libre. Le défi de la méthode réside d'abord dans la bonne encapsulation et d'autre part, à la validation des avantages résultant de l'encapsulation de fortes concentrations du colorant. En comparant les propriétés de formation d'image pour traitement de liposomes avec celle du colorant libre et également avec une formulation non trempé liposome avec de faibles concentrations de colorant est indispensable. Nous montrons par un protocole simple, mais très efficace hydratation du film et extrusion combinée avec le gel et de dégel des cycles alternés que l'encapsulation des concentrations de trempe de DY-676-COOH dans des liposomes est possible. D'autres procédés utilisés pour préparer des liposomes, tels que le procédé d'evaporation en phase inverse 23 ainsi que la méthode d'injection d'éthanol 24 permettent la préparation de liposomes avec des rendements élevés d'encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, la nature de la substance à encapsuler peut influer sur l'efficacité d'encapsulation. En effet,l'hydratation du film et de l'extrusion protocole présenté ici a révélé la plus grande efficacité pour l'encapsulation de DY-676-COOH. Pour illustrer les avantages de l'encapsulation liposomale de DY-676-COOH, un modèle de l'oedème induit par le zymosan, ce qui permet l'étude des processus inflammatoires dans les quelques heures, a été utilisé. Ici, il est démontré que les liposomes avec des concentrations élevées de la DY-676-COOH encapsulés sont plus appropriés pour le corps entier en imagerie optique in vivo de processus inflammatoires que le colorant libre ou la formulation liposomale non trempé avec de faibles concentrations de colorant. Ainsi, le protocole sous-jacent fournit un procédé simple et rapide pour produire des liposomes fluorescents pour traitement et la validation de l'activation et leur potentiel imagerie à la fois in vitro et in vivo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures sont approuvées par le comité régional et des animaux conformément aux lignes directrices internationales sur l'utilisation éthique des animaux.
1. Préparation des matériaux et instruments
- Préparation d'une dispersion de vésicules formées spontanément (SFV)
- Dissoudre et préparer des solutions d'achat d'actions des phospholipides suivants: 214 mg / ml phosphatidylcholine d'oeuf (EPC), 134 mg / ml de cholestérol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [méthoxy (polyéthylène glycol) -2000] (sel d'ammonium) (mPEG 2000 -DSPE) et 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (sel d'ammonium) (NBD-DOPE) dans le chloroforme et stocker dans des flacons de verre.
- Fournir environ 3 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond et de transférer le volume approprié de la solution mère de phospholipides dans le ballon à fond rond pour préparer des liposomes composés de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE à un rapport molaire de 6,5: 3: 0,5. Pour le double marquage de fluorescence des liposomes ajouter 0,3% en moles NBD-DOPE à la solution de lipide.
- On évapore le chloroforme de la solution de phospholipide organique sous pression réduite (300 mbar) à 55 ° C en utilisant un évaporateur rotatif.
- Après un film de phospholipides homogène est formé, de réduire la pression à 10 mbar pendant 1-2 heures pour enlever le dépôt de chloroforme résiduel.
- Bien que le chloroforme se évapore, on dissout DY-676-COOH (6,181 uM) dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4 et remplir un vase de Dewar d'azote liquide. Allumez un bain à ultrasons et réglé à 50 ° C.
- Transférer un volume approprié (0,5 à 1 ml) de DY-676-COOH (6,181 uM) solution dans le ballon à fond rond pour hydrater le film de phospholipide sec et vortexer vigoureusement jusqu'à une vésicule formée spontanément (SFV) forme de dispersion. Assurez-vous que tous les phospholipides sont dispersés pour éviter la perte de lipides.
- Tra soigneusementnsfer le ballon à fond rond contenant la dispersion SFV dans l'azote liquide et congeler la dispersion de 3-5 min. Placez le ballon dans un bain à ultrasons à 50 ° C pour dégeler la dispersion puis la dispersion vortex vigoureusement pendant 1-2 min. Répétez cette procédure six fois, soit un total de sept cycles gel et de dégel.
- Extrusion du sFv de former des vésicules de liposomes homogènes
- Transférer la dispersion SFV dans une seringue de 1 ml (seringue-a) et extruder la dispersion à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm en utilisant une extrudeuse à LiposoFast-base-b dans la seringue.
- Extruder la dispersion de la seringue-b, de retour dans la seringue-a, puis répéter le cycle dix fois. Du fait de l'extrusion, la solution dans la seringue passe d'un aspect trouble à une dispersion limpide avec le temps. Après dix cycles (vingt étapes simples d'extrusion) retirer la seringue-b de l'appareil et extruder la dispersion pour la dernière fois de la seringue-un directement dans un stérile1,5 ml du tube de réaction.
- Purification des liposomes encapsulés DY-676-COOH à partir de colorant libre
- Préparer une colonne de Chromatographie sur gel G25 en utilisant des perles trempées dans du Tris 10 mM de tampon pH 7,4 (colonne de longueur 28 cm, diamètre 0,8 cm).
- Transférer 0,5 ml de dispersion de vésicules extrudé sur le lit de gel et de laisser l'évacuation de l'échantillon dans la matrice de gel.
- Éluer les liposomes avec Tris 10 mM pH 7,4 (figure 1A) et laver la colonne jusqu'à ce que les drains de colorant libre complètement hors de la colonne. Si besoin est, collecter et recycler le colorant libre par dessalage et de déshydratation selon les instructions du fabricant.
- Concentrer les liposomes éluées par ultracentrifugation (200 000 x g, 2 heures à 8 ° C) puis de les disperser dans un volume adéquat de tampon stérile 10 mM de Tris pH 7,4.
- Quantification de la concentration encapsulé DY-676-COOH
- Préparer une courbe d'étalonnage en dissolvant DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) dans du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant 0,1% de Triton X100.
- Dissoudre 2 pi (100 nmol de lipide finale de 50 mmol / L stock) des liposomes pendant 5 min à température ambiante dans du tampon Tris 100 pi contenant 1% de Triton X100 pour détruire les vésicules et la libération du colorant encapsulé. Puis diluer les échantillons avec du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 jusqu'à une concentration finale de Triton-X100 à 0,1% (v / v) faire un volume total de 1 ml. Préparer tous les échantillons en double.
- Mesurer l'absorption et l'émission de tous les échantillons (libre DY-676-COOH et le Triton-X100 traitée liposomes) à une excitation λ = 645 nm et une émission λ = 700 nm. Établir et utiliser une courbe d'étalonnage du colorant libre de déterminer la concentration de colorant encapsulé.
- Liposome caractérisation
- Déterminer la taille et le potentiel zêta de liposomes par diffusion dynamique de la lumière. Diluer les échantillons de liposomes avec filtre stérilisé (0,2 um) Tris 10 mM pH 7,4 à aconcentration de 100 à 300 pM (lipide). Transférer les échantillons dilués dans une cuvette jetable de faible volume et de mesurer l'échantillon selon les instructions du fabricant.
- Caractériser les liposomes par microscopie électronique à étayer la taille, l'intégrité et l'homogénéité des vésicules liposomiques selon des protocoles standards.
2. Validation de la fluorescence-trempe et activation des liposomes préparés
- L'analyse physico-chimique de la fluorescence et l'activation
- Préparer deux tubes de 1,5 ml pour le Lip-Q et deux tubes pour la libre DY-676-COOH. Transfert 100 nmol lipides totaux (2,38 de pi d'un / L Lip-Q solution stock de 42 mmol, contenant 138 pg / ml de la encapsulé DY-676-COOH) dans les tubes correspondants. Transfert Gratuit équivalent DY-676-COOH à la teneur en colorant de Lip-Q (0,38 pg qui résulte par exemple de 138 ug / 1000 pi x 2,38 pi Lip-Q utilisé). Incuber une baignoiree de chaque sonde à 4 ° C et congeler le second tube à -80 ° C pendant une nuit (16 h).
- Chauffer un bloc chauffant à 30 ° C. Remplir une boîte de refroidissement avec de la glace pilée et équilibrer une aliquote de tampon Tris 10 mM pH 7,4 à température ambiante.
- Retirer sondes de 4 ° C et équilibrer à température ambiante (enveloppé dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière) et rapidement dégeler sondes de -80 ° C à 30 ° C pendant 5 min. Refroidir les sondes décongelés sur de la glace pendant 1 min avant de les transférer à la température ambiante (également enveloppé dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière).
- Ajouter tampon Tris 10 mM (pH 7,4) à chacune des sondes à 100 ul volume final et équilibrer toutes les sondes à la température ambiante pendant 10 min.
- Pipette 80 ul de chaque sonde dans une cuvette de verre à faible volume et mesurer l'absorption de chaque sonde de 400 à 900 nm sur un spectromètre. Retour à la sonde de leurs tubes correspondants.
- Transférer 80 pi de chaque sonde dans une cuvette en verre appropriéet mesurer l'émission de fluorescence sur un spectrofluorimètre en excitant les sondes à 674 nm et en mesurant la fluorescence de 694 à 800 nm.
- L'absorption cellulaire et l'activation de fluorescence
- Obtenez et la culture les lignées cellulaires suivantes dans leurs milieux de culture correspondante en fonction des conditions standard (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% atmosphère humidifiée). Ici, en utilisant ce J774A.1 de la lignée cellulaire de macrophage murin (modifié par Dulbecco du milieu de Eagle additionné de 10% (en volume) de sérum / fœtal de veau), la lignée cellulaire de glioblastome humain U-118 mg (MEM contenant des vitamines essentielles et 10% (v / v) de sérum de veau foetal) et la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 (RPMI avec 5% de FCS).
- Manteau de 8 puits diapositives de chambre avec poly-L-lysine (ajouter 100 ul 0,001% de poly-L-lysine dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Solution Aspirer et laisser les diapositives de la chambre à sécher pendant au moins quatre heure à température ambiante sur un établi stérile. Rincer les lames de la chambre 3fois avec la solution saline tamponnée 200 pi de Hank puis les sceller avec de la paraffine et de feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C jusqu'à l'emploi.
- Alors que les diapositives de la chambre se tarissent, filtre stériliser les liposomes et solution de colorant et conserver à 4 ° C jusqu'à l'emploi.
- Pour l'analyse d'absorption de sonde avec l'ensemble du corps in vivo NIR Système d'imagerie par fluorescence, 5 préparer de petits flacons de culture de chacun des trois lignées de cellules de test (15 flacons au total). Graine 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg et des cellules HT-1080 par flacon de culture avec 5 ml de milieu de culture respectif (dans quintuples) et poussent de 16 à 24 heures. Parallèlement aux flacons de culture, ensemencer 30 000 cellules de chaque lignée cellulaire (J774A.1 et HT-1080) ou 20 000 cellules (U-118 mg) à 2 puits de la glissière de la chambre respectivement, et croître dans un milieu de culture de 500 ul pendant 16 à 24 h .
- Le lendemain, ajouter 100 nmol (montant de finale en lipides) de Lip-Q pour deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre.Immédiatement transférer 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C et le second flacon revenir à l'incubateur.
REMARQUE: Le volume des sondes ajouté dans les flacons et les diapositives de la chambre sont les mêmes, ce qui rend la concentration sur des lames de la chambre 10 fois plus élevé (5 ml est de 500 pi de milieu de culture). Cela est nécessaire parce que la détection microscopique est moins sensible que le système d'imagerie par fluorescence NIR où culots cellulaires dans les fioles sont imagés. - Ajouter la libre DY-676-COOH à une concentration équivalente à la teneur en colorant de Lip-Q pour les cellules dans deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre, puis transférer immédiatement 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C (d'épuisement de l'énergie) et l'autre ballon avec le coulisseau de la chambre arrière à l'incubateur. Incuber les cellules pendant 24 heures dans les conditions correspondantes. Les cellules dans le ballon sans sonde de servir de témoin non traité.
- NIRF l'imagerie et l'analyse semi-quantitative
- Après 24 heures la durée d'incubation, récolter les cellules dans des flacons en lavant les cellules deux fois avec une solution tamponnée de Hanks de sel (HBSS), puis racler les cellules dans 500 ul de HBSS et culot par centrifugation (5 min à 200 x g) dans 500 ul de tubes.
- Placer les tubes avec les culots cellulaires (HBSS) et dans un imageur NIRF et image en utilisant des filtres pour excitation (615-665 nm) et d'émission (coupe à> 700 nm).
- Déduire autofluorescence et d'évaluer l'intensité de la cible par rapport autofluorescence selon les instructions du fabricant. Cela vous donnera les niveaux semi-quantitatives de l'intensité de fluorescence en signal moyen (compte échelle / sec), qui représente les niveaux de comptage après calibrage pour le temps de l'exposition, gain de la caméra, binning et la profondeur de bits, de sorte que les mesures sont comparables entre eux.
- Analyse microscopique confocale
- Après 24 heures d'incubation, récolter les cellules sur des lames de chambre en lavant deux fois avec 500 ul HBSS.
- Fixer la CElls avec 200 ul de HBSS contenant 3,7% (v / v) de formaldehyde pendant 30 min à température ambiante.
- Alors que la fixation se passe, diluer la tache d'ADN, Hoechst-33258 1:50 avec une solution de montage.
- Après fixation, laver les cellules deux fois avec du HBSS puis séparer les chambres des lames de verre. Ajouter la solution de montage de 50 ul contenant l'ADN-tache sur chaque spot correspondant aux puits des diapositives de la chambre. Couvrir les cellules avec des lamelles de verre, sceller les bords avec vernis à ongles transparent et sécher à l'air pendant 10 min à température ambiante (foncé).
- cellules image sur un microscope à fluorescence approprié ou microscope confocal. Utilisez les excitation et d'émission paramètres suivants pour la visualisation des composants correspondants: noyaux (Hoechst-33258: excitation 405 nm, émission 420 à 480 nm). NBD-DOPE (lipide liposomique: excitation 488 nm, émission 530 nm). DY-676-COOH (NIR de colorant fluorescent: excitation 633-645 nm, émission 650 à 700 nm).
NOTE: Assurez-vous que le microscope à fluorescence d'unevailable est équipé de filtres appropriés qui permettent excitation et d'émission de longueurs d'onde supérieure à 630 nm.
Base-liposome 3. In Vivo imagerie par fluorescence de l'inflammation
- Préparation des animaux et des matériaux
- Maison 8-12 semaines, âgé de souris NMRI mâles pesant environ 36 g dans des conditions standard avec de la nourriture et de l'eau ad libitum.
- Sept jours avant le début des expériences, donner toutes les souris d'un régime alimentaire faible en phéophorbide afin de réduire l'autofluorescence des tissus.
- Vingt-quatre heures avant le début de chaque expérience, de se raser la souris à la zone souhaitée (par exemple, toute la zone arrière si l'imagerie de la jambe arrière de l'œdème est souhaitée).
- Peser les animaux et de calculer la quantité de sonde doit être injecté par souris (Lip-Q et Lip-dQ à 10 pmol (concentration de lipides) par kg de poids et sans DY-676-COOH (équivalent à teindre contenu de Lip-Q utilisé) .
- Image les animauxun corps de fluorescence NIR imageur avec les mêmes paramètres utilisés pour les culots cellulaires. Cette mesure fournit autofluorescence des animaux.
- Dissoudre 10 mg de zymosan A dans 1 ml de solution saline isotonique et de stocker toute une nuit à 4 ° C.
- L'induction de l'inflammation in vivo et l'imagerie NIRF
- Préparez 3 seringues par souris contenant les solutions suivantes. Remplir une seringue avec 50 ul de solution zymosan A (10 mg / ml) et de la seconde seringue avec 50 ul de solution saline isotonique. Remplissez la troisième seringue avec les sondes, lequel Lip-Q et Lip-DQ (10 pmol / kg de poids (lipides)) sont désignés pour les animaux d'essai et d'une connexion DY-676-COOH (concentration que dans Lip-Q) pour les animaux de contrôle. Assurez-vous que les sondes sont dilués avec HBSS stérile à 150 volume final ul.
- Appliquer la crème des yeux sur les yeux des animaux pour éviter la sécheresse et anesthésier les animaux avec 2% d'isoflurane jusqu'à ce qu'ils sont profondément endormis et ne réagit pas au toucher sur les pattes (cela prend environ 2 minutes).
- Placez la souris sur une natte chaude (toujours sous anesthésie) et injecter le zymosan A voie sous-cutanée de la solution sur la patte arrière droite et la solution saline sur la patte arrière gauche. Injectez immédiatement la sonde par voie intraveineuse et de l'image de l'animal par la suite, puis un temps record d'injection / mesure (que t = 0 h). Enregistrez les images résultantes que l'image cubes et répéter les étapes ci-dessus pour tous les autres animaux et les sondes respectives.
- Image les animaux tous les 2 h pour le post-injection de 10 h et post-injection puis à 24 h, en se assurant que le stade de la chambre de mesure est chaude (par exemple, en plaçant sous un tapis chaud), afin d'éviter l'hypothermie. Après chaque mesure, placer les animaux dans une cage avec de la nourriture et de l'eau ad libitum et placer la cage dans une chambre animale tempéré. Euthanasier les animaux par les premier anesthésiant avec 2% d'isoflurane jusqu'à ce que les animaux ne réagissent plus à toucher, puis euthanasier avec du dioxyde de carbone pour 5 à 10 min, ce qui rendassurer que les animaux cessent de respirer complètement et la rigidité cadavérique.
- Disséquer les souris selon des protocoles standards qui peuvent être évalués en ligne (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) et l'image des organes.
- Évaluer les résultats de mesure selon les instructions du fabricant d'abord déduisant la fluorescence globale des animaux (démixage) puis des régions attribution d'intérêt pour autofluorescence (de gauche patte arrière avec une solution saline) et la cible fluorescence de zone enflammée (de patte arrière droite avec zymosan-A).
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Representative Results
L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF DY676-COOH utilisé ici dans l'intérieur aqueux des liposomes entraîne un niveau élevé de l'extinction de fluorescence. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration, peut être exploitée dans plusieurs applications d'imagerie in vivo où une grande sensibilité et une détection fiable de la région cible sont demandés. L'utilisation de liposomes assure également la protection du colorant qui est indispensable pour des applications in vivo. Une caractérisation complète des liposomes est nécessaire et comprend plusieurs facteurs tels que le niveau de colorant encapsulé, la stabilité et la taille des liposomes, l'extinction de fluorescence et l'activité du colorant encapsulé in vitro et également applicable à des fins d'imagerie in vivo. Une comparaison du colorant libre, DY-676-COOH et des liposomes pour traitement (Lip-Q) ainsi que d'un liposome non trempée (Lip-dQ) à très faible concentration du colorant encapsulé est donc essentiel surtout pour les caractérisations in vivo.
Les liposomes préparés à l'aide de l'hydratation du film et de la technique d'extrusion avec des cycles de congélation successifs et dégel avant l'extrusion contiennent des molécules de colorant libres résiduels qui peuvent être séparés avec succès à partir des liposomes en raison de leur plus longue rétention dans la matrice de filtration sur gel, par rapport aux liposomes qui éluent plus rapidement ( Figure 1B). En fonction du niveau de dilution après la filtration sur gel, une étape d'ultracentrifugation en option permet la concentration des liposomes comme illustré (figure 1C). Sur la base des propriétés d'absorption et d'émission du colorant encapsulé, la concentration de colorant encapsulé est déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage du colorant libre (Figure 1D). En plus de la concentration du colorant encapsulé, il est important de déterminer la taille et l'homogénéité des liposomes arrièrepréparation er. Comme on le voit sur la figure 1E, micrographies électroniques de liposomes préparés par le procédé sous-jacent révèlent une morphologie essentiellement unilamellaires des vésicules liposomiques contenant intravésiculaire DY-676-COOH soit dans la plage de concentration de trempe (Lip-Q; 606-846 uM DY-676 ) ou à une concentration de colorant non trempé (Lip-DQ; 25 uM DY-676). De plus, ils révèlent une distribution de taille homogène d'environ 120 nm et une polydispersité indices loin inférieur à 1 (tableau 1). En raison de l'extinction de fluorescence, Lip-Q présente deux maxima d'absorption dans un tampon aqueux, dans lequel un pic est caractérisé par un déplacement vers les longueurs d'onde bleues. Dans cette optique, l'émission de fluorescence est très faible par rapport au colorant libre (figure 2A et B, à droite). Congelez-dommages des résultats liposomes dans la libération du colorant, qui est dilué dans la solution environnante. Le pic d'absorption de décalée vers le bleu donc de disappears, résultant en un seul pic d'absorption de Lip-Q. Correspondant à cela, une augmentation de l'intensité de fluorescence du gel endommagé Lip-Q est considérée, ce qui indique que l'activation de la fluorescence des molécules de colorant libéré a eu lieu. Le colorant libre révèle qu'un seul maximum d'absorption et l'intensité de fluorescence élevée qui restent au même niveau, quel que soit le gel (Figure 2A et B, à gauche). Cette constatation suggère que l'encapsulation du colorant dans des liposomes, comme dans Lip-Q protégerait le colorant à partir de l'environnement, de conserver une concentration élevée et l'extinction de la fluorescence associée et se il est activé par des déclencheurs cibles permettant la détection due à l'augmentation de la fluorescence.
sondes liposomales avec la composition lipidique sous-jacent révèle une absorption phagocytaire prédominant qui est inhibée par épuisement de l'énergie. Ceci peut être vu par l'absorption de Lip-Q murine par la J774A.1 lignée cellulaire de macrophages phagocytaires fortement, et lalégèrement phagocytaire lignée cellulaire de glioblastome humain U-118 mg à 37 ° C et l'inhibition à 4 ° C (Figure 3A et B). Le colorant libre DY-676-COOH absorption révèle dans les lignées de cellules phagocytaires à la fois à 37 ° C et à 4 ° C, ce qui indique que la sonde liposomale Lip-Q ne contient pas de colorant résiduel libre dans la solution et ne peut que subir une absorption active. Balayage laser images microscopiques confocales corroborent en outre l'activation de l'absorption et Lip-Q dans les cellules phagocytaires (figure 3C). En outre, l'absence de fluorescence à la ligne non-phagocytaire de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 indique que l'absorption de Lip-Q est principalement par phagocytose et, par conséquent, serait apte à l'imagerie de l'inflammation où phagocytaires monocytes / macrophages sont impliqués.
Conformément à l'absorption phagocytaire des liposomes observés dans des lignées cellulaires en culture, et du fait de la trempe de fluorescence injection intraveineuse de Lip-Q de temps conduit à uneaugmentation dépendante de l'intensité de fluorescence de l'œdème dans les modèles de souris (Figure 4A, Lip-Q), avec une très faible fluorescence de fond. L'intensité de fluorescence maximale de l'œdème est détecté 8-10 après l'injection h de Lip-Q. Au contraire, relativement forte fluorescence NIR de l'ensemble souris est observée après l'application de la libre DY-676-COOH (Figure 4A, DY-676-COOH) ou la always-on liposome, Lip-dQ (figure 4A, Lip-dQ ). Comparé à Lip-Q, la perfusion et le dédouanement rapides de la libre DY-676-COOH vu 0-4 après l'injection h, interfère avec l'imagerie, de sorte que la détection fiable de l'oedème ne est pas possible (figure 4A, DY-676-COOH ). En outre, le liposome non trempé, Lip-dQ révèle une fluorescence maximale à l'intérieur de l'oedème post-injection 4.2 hr qui reste à peu près constante jusqu'à 8 heures, puis diminue progressivement similaire à la fluorescence en fonction de l'oedème-Lip-Q trempé. Exécution anale semi-quantitativeYses, lequel régions d'intérêt (ROI) sont fixés pour l'oedème par rapport arrière-plan, on peut tirer des conclusions sur les différents niveaux de détection avec différentes sondes. Selon l'analyse semi-quantitative de cinq animaux par groupe (sonde), l'œdème peut être plus significative (P = 0,001) détecté avec Lip-Q qu'avec la libre DY-676-COOH ou la non-trempé, Lip-DQ (Figure 4B).
organes d'imagerie de souris euthanasiés 24 après l'injection h de sondes révèlent légère ex vivo par fluorescence du foie / vésicule biliaire et les reins et une très faible ou pas de fluorescence de la rate, les poumons et le cœur (Figure 5), qui sert de preuve pour l'élimination des sondes à travers la voie hépatobiliaire.
Figure 1: Préparation de liposome DY-676-COOH-chargéss. (AC) aperçu schématique des étapes de synthèse en cause. (A) Configuration de l'hydratation du film et extrusion avec le proche infrarouge colorant DY-676-COOH. (B) Image de la configuration du self-made-filtration sur gel montrant l'interphase entre colorant et liposomes (gratuit) non encapsulée. Les liposomes sont élues première et apparaissent bleu-vert en raison de la DY-676-COOH encapsulé (bleu) et le phospholipide verte incorporée, NBD-DOPE. (C) d'image représentant de liposome-sédiments (Lip-Q) après concentration par ultracentrifugation. ( D) Représentant de courbe d'étalonnage de DY-676-COOH dans 10 mM Tris pH 7,4 (contenant 1% de Triton X100) utilisé pour la quantification des liposomale colorant. (E) micrographie électronique Cryo-de transmission de Lip-Q. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
Figure 2:. Détermination physico-extinction de fluorescence et l'activation in vitro (A) spectres d'absorption de Lip-Q (à droite) et sans DY-676-COOH (à gauche) mesurée dans un tampon Tris 10 mM pH 7,4, avant ou après congélation à - 80 ° C. Notez le double pic caractéristique de Lip-Q par rapport à la libre DY-676-COOH et la disparition du pic décalée vers le bleu après le gel des dommages de Lip-Q. (B) correspondant spectres d'émission de fluorescence de Lip-Q (à droite) et libre DY-676-COOH (à gauche) mesurée dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4 avant ou après congélation à -80 ° C.
Figure 3: L'absorption cellulaire et la fluorescence activation de la lèvre osomes. Les images en (A) ont été préparés par imagerie de fluorescence NIR de culots cellulaires après exposition à des sondes correspondantes pour 24 heures aux températures indiquées. Les cellules HT-1080 ne ont pas survécu aux périodes d'incubation de 24 heures à 4 ° C. Les diagrammes à barres dans (B) représentent les niveaux de semi-quantitative des signaux de fluorescence obtenu en attribuant ROI pour les culots cellulaires dans A. Chaque barre représente le intensités moyennes de n = 3 expériences ± SD. Images dans (C) ont été acquises par microscopie confocale à balayage laser de cellules exposées à des sondes sur la culture diapositives de chambre pendant 24 heures à 37 ° C. Notez le niveau élevé de fluorescence dans la phagocytose de souris J774A.1 haute lignée cellulaire de macrophages et la fluorescence moyenne dans la lignée cellulaire de glioblastome humain U-phagocytaire doux 118 mg. La lignée cellulaire de fibrosarcome humain HT-1080 non-phagocytaires ne montre aucune fluorescence des sondes. NBD-DOPE: phospholipides fluorescente verte.charge / 52136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
Figure 4. Dans l'imagerie optique in vivo de l'oedème induit zymosan chez la souris. (A) L'image de la souris sur la gauche montre les positions des sous-cutanée appliquées zymosan-A (500 ug dans 50 ul solution saline) et la solution saline de contrôle (50 pi) sur le flanc gauche. L'injection intraveineuse des sondes indiquées et tout le corps NIR imagerie de fluorescence au niveau des points de temps indiqués révéler progressive, mais forte augmentation des signaux de fluorescence de l'œdème et une faible fond signaux de Lip-Q (panneau supérieur) avec un maximum de fluorescence après l'injection de 8 heures. Le colorant libre révèle perfusion et le dédouanement rapide dans après l'injection de 4 heures (volet du milieul), alors que Lip-DQ révèle la détection de l'oedème avec des intensités de signaux faibles et une plus fluorescence de fond global. La présentation graphique dans (B) réitérer les signaux de fluorescence détectée de l'oedème observé avec chaque sonde par rapport à la région de contrôle (solution saline) n = 5 animaux par groupe. Chaque parcelle représente les signaux de fluorescence de moyennes (n = 5) ± SEM. Avec les graphiques, le signal de fluorescence maximale de l'œdème détecté avec chaque sonde se distingue facilement (Lip-Q, 8 h; Lip-DQ 2-4 h et gratuitement DY-676-COOH, après l'injection de 2 heures). Il ya une intensité de fluorescence de manière significative (P = 0,001) plus élevé de l'oedème avec Lip-Q par rapport Lip-dQ à t = 0-24 h, et avec Lip-Q par rapport gratuit DY-676-COOH à t = 4-24 h. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
Figure 5: Bio-optiques ex vivo des images des organes de souris application en post de la sonde de 24 heures, et l'analyse semi-quantitative correspondante de l'intensité de fluorescence des organes. Chaque barre représente la moyenne des intensités de fluorescence (n = 4) ± SEM. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
| formulation de liposomes | Taille [nm] | Indice de polydispersité (PI) | Zeta potentiel [mV] |
| Lip-DQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0,055 ± 0,02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (éteint) | 118,5 ± 0,7 | 0,04 ± 0,02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (w / o DY-676-COOH) | 123,0 ± 1,4 | 0,04 ± 0,03 | -11 ± 1 |
Tableau 1: Caractérisation des liposomes par diffusion dynamique de la lumière.
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Discussion
Étant donné que les liposomes peuvent également servir de systèmes de délivrance pour des colorants fluorescents, ils permettent l'imagerie des maladies cibles. L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF, DY676-COOH utilisé ici, conduit à un niveau élevé de l'extinction de fluorescence du colorant piégé. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration peut être exploitée dans plusieurs applications d'imagerie in vivo, où une grande sensibilité et une détection fiable de la zone cible est exigé. L'utilisation de liposomes assure également la protection du colorant qui est indispensable pour des applications in vivo.
La technique de l'hydratation de la pellicule et l'extrusion est un procédé largement utilisé, qui permet une bonne préparation de liposomes ayant des gammes de tailles en fonction des besoins, et permet des modifications telles que l'encapsulation d'une multitude de substances différentes 25. Ainsi, il est approprié pour la préparation de la lèvreosomes encapsulé avec le colorant fluorescent proche infrarouge, DY-676-COOH à des fins d'imagerie. Le procédé donne des liposomes ayant des concentrations de colorant intravésiculaires de 600-840 pm, qui sont de la trempe de la concentration de colorant. L'extrudeuse LiposoFast-part de base utilisé pour l'homogénéisation de la dispersion de vésicules formées spontanément est approprié pour la préparation de liposomes à petite échelle de laboratoire, en raison de la compatibilité du dispositif avec les seringues jusqu'à 1 ml de volume. Pour des préparations à grande échelle, l'utilisation de plus grandes homogénéisateurs haute pression qui sont capables d'homogénéiser dispersions de vésicules ayant une capacité de 1000 litres par heure est recommandée. La filtration sur gel (exclusion de taille) chromatographie est une étape cruciale qui assure la séparation du colorant encapsulé dans des liposomes à partir de molécules non-encapsulée (gratuit) colorant 26. La longueur de la colonne de filtration sur gel est indispensable pour une séparation efficace des liposomes de colorant libre. Ainsi, il est nécessaire de préparer une colonne d'au moins 28 cm de longueur to séparer avec succès les liposomes de la libre DY-676-COOH utilisée ici. Fait intéressant, cette longueur est deux fois plus long que celui utilisé pour purifier carboxyfluorescéine (CF) à partir de liposomes chargés carboxyfluorescéine libre. L'inconvénient majeur de la filtration sur gel est de cinq à six fois la dilution des échantillons purifiés. Ceci peut être compensé par ultracentrifugation, si liposomes hautement concentrées sont nécessaires. Pendant ultracentrifugation les liposomes sédiments et le surnageant peuvent être enlevées facilement 27. Autres façons de concentrer des liposomes tels que par dialyse 28 sont plus de temps que ultracentrifugation.
Outre le procédé d'hydratation du film et de l'extrusion, le procédé d'evaporation en phase inverse 23 ainsi que la méthode d'injection d'éthanol 24 permettent la préparation de liposomes avec une haute efficacité d'encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, nos études ont révélé l'hydratation du film combiné avec le cycle de congélation et décongélations pour être la méthode la plus appropriée pour une encapsulation suffisante de intraliposomale DY-676-COOH. L'augmentation de la concentration de départ DY-676-COOH utilisé pour le film hydratation augmente l'efficacité et de la concentration du colorant intraliposomale, quand une concentration en lipide de 30 mM fixe est utilisé. En dépit de cette efficacité de l'encapsulation par le procédé de congélation et décongélation est inférieure à 10% de la concentration de colorant de départ utilisé, mais cependant suffisante pour que l'encapsulation est de la concentration d'extinction nécessaire pour l'imagerie. En outre, le colorant libre séparée de liposomes par filtration sur gel peut être recyclé par la déshydratation et de dessalage selon les instructions du fabricant, ce qui rend possible ré-encapsulation et une perte globale de colorant minimale. L'encapsulation du colorant par le protocole sous-jacent n'a aucune influence sur la taille et la morphologie des liposomes comme on le voit par les indices de polydispersité et la micrographie électronique de Lip-Q.
Plusieurs méthodes simples peuvent être utilisés pour évaluate l'activité de prêt fluorescente liposomes.DY-676-COOH a une forte tendance à l'auto-trempe à des concentrations élevées 21,29 probablement résultant de la formation H-dimère et interactions pi-empilage entre molécules de colorant. Ces interactions, qui se produisent en raison de la proximité des rayons Förster des molécules de colorant à des concentrations élevées, peuvent être anéantis par dilution 30. Par conséquent, l'encapsulation de concentrations élevées de DY-676-COOH ne protège pas seulement le colorant d'opsonisation in vivo, mais aussi de la mémoire tampon environnante, maintenant ainsi sa forte concentration et de retenir la fluorescence qui peut être détecté comme une absorption décalée vers le bleu pic et une faible émission de fluorescence comme on le voit sur la figure 2. La congélation des liposomes progressivement à -80 ° C conduit à la formation de cristaux de glace dans l'intérieur aqueux 31 qui provoque des dommages à la membrane liposomale lorsque inconsidérément décongelées à 30 ° C. La diffusion, la dilution et la fluorescence activation de la intra-liposomale DY-676-COOH dans un tampon après congélation est révélé dans un pic d'absorption unique et presque 2,5 fois augmentation de l'intensité de fluorescence (Figure 2), ce qui indique que Lip-Q séquestre ainsi une haute concentration trempe de DY-676-COOH et est activable. D'autres méthodes d'endommager liposomale bicouche lipidique tels que l'utilisation de détergents ou de solvants organiques ne révèlent pas de différences claires entre le colorant libre et le colorant encapsulé dans des liposomes, car ils influencent à la fois les propriétés spectrales de nombreux colorants fluorescents 32. La congélation lente et la méthode de décongélation dure rapportée ici sert donc une méthode plus fiable et prometteur pour valider la haute encapsulation de fluorophores dans des liposomes et extinction de la fluorescence conséquente. À partir des spectres d'absorption et d'émission de intact Lip-Q (figure 2), un certain degré de fluorescence résiduelle peut être détectée. Il peut en résulter de monomères non trempé colorant au sein de la liposomes et aussi de l'interaction électrostatique et l'influence de colorant encapsulé par phospholipides groupes de tête polaires 33.
Comme on peut le voir sur la figure 3, une accumulation nette de Lip-Q dans le macrophage murin hautement phagocytaire et la ligne humain phagocytaire doux glioblastome cellulaire U-118 mg 34, mais pas dans la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 non phagocytaire, indique que Lip-Q- imagerie de l'inflammation base serait favorable, puisque les phagocytes sont les principaux acteurs des processus inflammatoires. Le fait que l'épuisement de l'énergie supprime l'absorption de Lip-Q, mais pas l'absorption de la libre DY-676-COOH, en démontrant la spécificité de l'absorption phagocytaire de Lip-Q et révèle que Lip-Q reste intact pendant l'expérience, la libération d'autre du colorant et absorption indépendance énergétique aurait lieu conduisant à détection de fluorescence. Incorporation le phospholipide fluorescente verte, NBD-DOPE dans la bicouche de liposome et permet l'imagerie microscopique discrimination entre non dégradés à partir de liposomes dégradées cellulaires surtout si expériences d'absorption en fonction du temps se font comme précédemment indiqué 32. Les images microscopiques révèlent NIR fluorescence de DY-676-COOH qui, en corrélation avec les niveaux d'intensités de fluorescence des culots de cellules, comme déterminé par analyse semi-quantitative après incubation à 37 ° C. Conformément à cela, les lignées de cellules macrophages murines présentent la plus forte fluorescence, tandis que le glioblastome humain révèle une fluorescence plus faible des deux DY-676-COOH et NBD-DOPE que le premier. Comme prévu, la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 ne ont pas révélé de fluorescence soit des colorants liposomales ou la libre DY-676-COOH, ce qui renforce le fait que l'absorption Lip-Q, est principalement par phagocytose.
Pour étudier le potentiel de Lip-Q-fondé dans l'imagerie in vivo de l'inflammation entraîné la phagocytose, plusieurs contrôles ont été examinées. Considérant que la libre DY-676-COOH peut être repris par phagocytosis, opsonisation des Lip-Q peut conduire à la libération de la teinture, qui peut être repris par les phagocytes. Pour éviter cela, Lip-Q a été préparé avec 5% mol PEGylation. En outre, il est nécessaire de faire la distinction entre l'absorption due à l'effet de EPR-inflammation et la base absorption active et l'activation de fluorescence. Pour y remédier, l'évaluation et la comparaison des trois sondes différentes, à savoir le toujours en service, Lip-DQ, le Lip-Q trempé et la libre DY-676-COOH chez des souris porteuses oedème induit zymosane était nécessaire. Zymosan-A, qui est préparé à partir des parois des cellules de Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans est un stimulant naturel de la sécrétion de cytokines par l'intermédiaire de la Dectine-1 et le récepteur de type Toll 6.2 (TLR 2/6). Cytokines sécrétées à leur tour induisent l'activation de cascades en aval qui se traduisent par des fuites vasculaires, facilitant ainsi l'intravasation / extravasation des monocytes / macrophages spléniques d'un réservoir 35 ainsi que les neutrophiles, et leur migration vers les sites inflammatoires(Œdème) 36-39. Le processus monocytes base de zymosan / macrophages extravasation et la migration n'a besoin que de 4,5 à 6 h, ce qui rend zymosan un outil stratégique pour étudier les processus inflammatoires 36-39. En raison des fuites vasculaires qui résultent cours de l'inflammation, injecté par voie intraveineuse sondes peuvent soit être prises par les monocytes / macrophages (phagocytes) au cours de leur migration vers le site de l'inflammation ou l'extravasation et être repris sur le site de l'oedème (effet EPR) 40. L'utilisation de la lèvre non-DQ trempé révèle un fort arrière-plan de l'ensemble des signaux d'œdème que Lip-Q, et une augmentation de la fluorescence de l'œdème qui reflète la migration des monocytes et des macrophages. En effet, la fluorescence maximale de l'œdème est déjà vu après l'application de 2-4 h de Lip-DQ et reste presque constant jusqu'à 8 h. Opposé à Lip-DQ et Lip-Q, la libre DY-676-COOH subit perfusion rapide après l'injection et est effacé au sein de quatre heures, de sorte que l'imagerie distincte de l'oedème ne est pas possible. Enterestingly, l'utilisation des résultats de bouche-Q en augmentation persistante de l'intensité de fluorescence de l'œdème et les signaux de fond très bas. Cette augmentation persistante intensités de fluorescence avec Lip-Q est attribuée à l'activation de la fluorescence liposomale publié colorant. Pris ensemble, on peut conclure que la contribution des EPR effet en imagerie basée Lip-Q est minime, car Lip-DQ révèle une fluorescence maximale (effet EPR et la migration des monocytes) après l'injection de 4 heures. Ainsi, l'encapsulation liposomale et offre une protection distincte de livraison DY-676-COOH, ce qui permet un plus fiable l'imagerie in vivo de l'oedème, uniquement après l'internalisation et la dégradation (activation de fluorescence) par des cellules phagocytaires. Jusqu'à présent, l'utilisation de la patte arrière de l'oedème induit par le zymosan pour valider les propriétés d'imagerie de liposomes fluorescents est nouveau. Le protocole ci-incluses peut être étendu à la fois par l'encapsulation de colorants fluorescents différents et en imageant l'effet inhibiteur de différentes drugs sur l'induction de l'inflammation, et représente donc un outil utile pour la préparation et la caractérisation des sondes appropriées pour l'imagerie biomédicale.
Une autre étape cruciale vers la définition des sondes d'imagerie appropriés est la vérification de leurs propriétés pharmacologiques et voies d'élimination. La distribution dans les organes de sondes qui jouent un rôle vital dans l'excrétion, tels que le foie et les reins ainsi que leur rétention court et l'élimination appropriée de ces organes est habituellement une indication que les sondes se montrer beaucoup plus probablement pas d'effets indésirables sur le patient. Conformément à cela, les organes de souris préparées 24 après l'injection d'heure de Lip-Q ou la libre DY-676-COOH révéler seulement fluorescence doux du foie / vésicule biliaire et des reins, ce qui signifie une élimination préférentielle du fluorophore liposomale par la voie hépatobiliaire. L'hébergement de courte des sondes dans ces organes et leur élimination efficace est étayée par un 7-fold signaux de fluorescence élevés de organes préparés 6 après l'injection h de Lip-Q ou la libre DY-676-COOH 32. Ces observations sont conformes à l'élimination des liposomes 41 et sauvegarde l'importance d'inclure des études de biodistribution lors de la caractérisation des sondes. Bien que les effets secondaires indésirables, tels que les irritations de la peau et l'activation 42,43 complément ont été rapportées pour des formulations liposomales utilisées dans des applications cliniques, ces effets ne ont pas été détectées avec les liposomes sous-jacents. En outre, l'observation des souris immunodéficientes pendant deux semaines après injection de la sonde conduit à compléter la clairance des sondes provenant des organes des souris (non représentée).
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 et RU-1652 / 1-1. Nous remercions Doreen mai pour une excellente assistance technique et la société Dyomics GmbH, Jena pour leur soutien en nature.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
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