Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neural stamcelletransplantation i Eksperimentel Contusive Model for Rygmarvsskader

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Rygmarvsskade er en traumatisk tilstand, der forårsager alvorlig sygelighed og høj dødelighed. I dette arbejde har vi beskriver i detaljer en kontusion model af rygmarvsskade i mus, efterfulgt af en transplantation af neurale stamceller.

Abstract

Rygmarvsskade er en ødelæggende klinisk tilstand, kendetegnet ved et kompleks af neurologiske dysfunktioner. Dyremodeller for rygmarvsskade kan bruges både til at undersøge de biologiske reaktioner af skader og til at teste potentielle behandlinger. Kontusion eller kompression skade leveres til kirurgisk eksponeret rygmarven er de mest anvendte modeller af patologi. I denne rapport den eksperimentelle kontusion udføres ved hjælp af Infinite Horizon (IH) Impactor anordning, som gør det muligt at oprette en reproducerbar skade dyremodel gennem fastlæggelse af specifikke skade parametre. Stamcelletransplantation er almindeligt anset for en potentielt nyttig strategi for at kurere denne invaliderende tilstand. Talrige undersøgelser har evalueret virkningen af ​​transplantere en række stamceller. Her vise vi en tilpasset fremgangsmåde til rygmarvsskade efterfulgt af haleveneinjektion af celler i CD1 mus. Kort sagt, vi leverer procedurer for: i) cellemærkning with en vital sporstof, ii) præoperativ pleje af mus, iii) gennemførelse af en contusive rygmarvsskade, og iv) intravenøs administration af post mortem neurale forstadier. Denne kontusion model kan anvendes til at evaluere effekten og sikkerheden af ​​stamcelletransplantation i en regenerativ medicin tilgang.

Introduction

En rygmarvsskade (SCI) er den mest almindelige skade forårsaget af højenergi traumer lignende motorkøretøjer ulykker, fald, sport og vold 1. Ved svær SCI, skaden kraft ødelægger eller skader nervevæv, der forårsager pludselige tab af neurologiske funktion. Traumatisk SCI ofte opstår hos unge voksne mellem 10 og 40 år. Det i høj grad påvirker patientens psykiske og fysiske tilstand og forårsager enorme økonomiske konsekvenser for samfundet 2. Behandlingen tilgang i den akutte fase er ofte begrænset til en høj dosis af kortikosteroid, kirurgisk stabilisering og dekompression til eventuelt dæmpe yderligere skader 3-4, men rollerne for disse metoder på bevægeapparatet opsving efter SCI er stadig kontroversiel. Ud over akut tab af væv, traumatiske skader og aktiveringen af sekundære mekanismer degeneration årsag demyelinering og død af flere celletyper 5-6. Graden af ​​genvinding af funktionen kan afti korreleres til udstrækningen af sparet hvide substans ved læsionsstedet 7.

Dyremodeller af SCI kan anvendes både til at undersøge de biologiske reaktioner i vævet skade og til at teste potentielle terapier. Desuden er en nyttig dyremodel for en menneskelig patologi ikke blot at gengive nogle aspekter af denne betingelse, men også skal tilbyde fordele i forhold direkte klinisk observation og eksperiment. De mest udbredte modeller af rygmarvsskade involverer kontusion eller kompression skade leveres til kirurgisk udsatte rygmarven 8. Udviklingen af ​​en kontrolleret vægt-drop kontusion skade udgør en vigtig milepæl i historien om SCI forskning. Den Ohio State University rygmarv forskningscenter udøvet den teknologiske udfordring af en anordning, der kan bruges til at fremkalde en bestemt kompression af rygmarven med parametre for effekt styres af en computer 9. Dette blev oprindeligt designet til brug with rotter; senere blev det ændret til at anvende over for mus 10. Fordelene ved denne form for tilgang er, at biomekanik skaden kan studeres mere i dybden og parametrene for skaden kan defineres på en mere fuldstændig måde for at opnå en reproducerbar eksperimentel model, derfor tillader mere præcis vurdering af virkningerne af testede behandlinger på den funktionelle helbredelsesprocessen.

Mange undersøgelser har evalueret transplantation virkninger af en bred vifte af stamceller i SCI-modeller 11. Vi har voksne neurale stamceller fra Sub-ventrikulær zone (SVZ) flere timer nylig isoleret efter død mus donor 12-13. Denne procedure giver en population af neurale stamceller, kaldet post mortem neurale forstadier (PM-NPCs), som synes at være fordelagtigt i en regenerativ medicin fremgangsmåde til hærdning SCI. I dette papir vil vi demonstrere: i) protokollen for celle mærkning med den vitale sporstof PKH26, ii) Surgical procedure at udføre på traumatisk SCI, og iii) intravenøs (IV) administration af mærkede celler. Desuden i dette arbejde viser vi, at transplanterede celler migrerer til rygmarv læsioner sites og differentiere det meste i mikrotubuli protein (MAP) 2-positive celler. Endvidere er differentieringen ledsaget af fremme en stabil genvinding af bagbenet funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle procedurer blev godkendt af Review Committee for universitetet i Milano og mødte de italienske retningslinjer for forsøgsdyr i overensstemmelse med Europæiske Fællesskabets direktiv fra november 1986 (86/609 / EØF).

1. Fremstilling af celler til transplantation

BEMÆRK: Brug neurale stamceller mellem 5. og 9. passage i kultur i disse forsøg; teste kulturer til proliferation og differentiering evne før at blive stemplet til transplantation. Bestemme omfanget af differentiering med immuncytokemi 12.

  1. Resuspender celler til en koncentration på 1 x 10 6 celler / 150 pi (transplantation 1 x 10 6 celler pr mus). Forbered mindst 1,2 x 10 6 celler per mus, fordi et overskud af celler er påkrævet for sprøjten loading formål.
  2. Vask cellerne 3 gange ved anvendelse af neural stamcelle medium 13 i et 10 ml konisk hætteglas. I hvertvasketrin bundfald cellerne ved centrifugering (500 x g i 5 min, RT).
  3. Tæl celler, før den endelige spin.
  4. Centrifuger cellerne (500 xg i 5 min), og derefter aspireres supernatanten, og pas på ikke at fjerne eventuelle celler, men efterlader ikke mere end 25 pi supernatant.
  5. Forbered en 2x celle suspension ved at tilsætte 1 ml solvens C til cellepelleten og resuspender med forsigtig pipettering.
  6. Umiddelbart før farvning fremstilles en 2x farveopløsning (4 x 10-6 M) i Diluent C ved tilsætning af 4 pi af PKH26 ethanol farveopløsning til 1 ml diluent C i et rør, og bland godt for at dispergere.
  7. Hurtigt tilføje 1 ml 2x cellesuspension til 1 ml 2x farveopløsning og straks Prøven blandes ved pipettering (endelig celledensitet vil være 1,2 x 10 7 celler / ml og 2 x 10-6 M PKH26).
  8. Inkubér celle / farvestof suspension 1-5 min.
  9. Stop farvning ved tilsætning af en tilsvarende mængde (2ml) af 1% BSA-opløsning i HBSS og inkuberes i 1 min.
  10. Centrifuger celler (500 x g i 10 min) og fjern forsigtigt supernatanten.
  11. Resuspender cellepellet i 10 ml HBSS og centrifugeres (500 xg i 5 min).
  12. Vask cellepelleten 2 gange med 10 ml komplet medium for at sikre fjernelse af ubundet farvestof.
  13. Resuspender cellepelleten i 10 ml komplet medium til vurdering af celleindvinding, cellelevedygtighed og fluorescensintensitet. Hvis der er behov for celler til transplantation, vask og resuspender dem i en steril fysiologisk opløsning ved en koncentration på 3,3 x 10 5 celler / 50 pi.

2. Forberedelse til operation

  1. Ren og sterilisere kirurgi udstyr.
  2. Forbered kirurgi området ved at tørre med en aseptisk middel. Opsætning af IH Impactor enheden.
  3. Forbered anæstesiapparater: Active Gas Scavenger med VetScav Filter vejeindretning, kontinuerlig strøm induktion Afdeling, Oxygen Genedøråbneren, Low Flow O 2 Meter for mus. Rengør induktion kammeret og masken anvendes under kirurgi.
  4. Bedøver dyr med 2,5% (v / v) isofluran i oxygen (1 L / min), og vent 5 minutter efter flow induktion for lægemidlet at virke. Kontroller, om de knurhår er trækninger eller hvis der er langsom bagben tilbagetrækning som reaktion på klemme trædepuden. Under operationen, reducere isofluran koncentration til 2,0% (v / v) isofluran i oxygen (1 L / min).

3. Forberedelse af mus for Kirurgi og transplantation

  1. Hold den mandlige voksne CD1 mus (25-30 g) i mindst 3 dage før eksperimenterne i standardbetingelser (22 ± 2 ° C, 65% luftfugtighed, og kunstlys mellem 8:00 til 8:00).
    BEMÆRK: Hele proceduren fra kirurgisk forberedelse til suturering vil tage omkring 40 min.
    1. For at identificere dyret, markere halen ved hjælp af vandafvisende farvet blæk.
  2. Brug en strømic clipper at skære dorsale hår af musen fra halsen, om på T2 plan til den lumbale område.
  3. Steriliser forberedte område med en iodid opløsning og ethanol (70% i sterilt vand).
  4. Behandle dyret med en sub kutan (sc) injektion af 200 pi gentamycin (1 mg / ml i steril saltopløsning).
  5. Anvend ophthalmisk smøremiddel for både dyrs øjne for at forhindre udtørring og injicere buprenorphin (subkutant, 0,03 mg / kg) for at lindre smerter.

4. laminektomi

  1. Placer musen på et dias varmere at undgå problemet med hypotermi under operationen. Placer dyret med den dorsale side op.
  2. Lav en lodret snit med en skalpel i området af interesse, fra T7 til T12.
  3. Hold huden og overfladiske fedtpude ved anvendelse af standard pincet (normalt findes i rummet mellem den 5. og 6. thorax dorsale processer).
  4. Tæl processen under beholderen som T6derefter flytte til T7.
  5. Placer en lille indflydelse under den ventrale side af musen til at øge krumning af rygsøjlen. Immobilisere rygmarven ved at blokere det med Graefe pincet.
  6. Skær paravertebrale muskler bilateralt fra T7 og T10 vertebral niveau ved hjælp af skalpel, indtil den dorsale overflade af lamina kontakt skalpel tip.
  7. Brug skalpel til at afkrydse krydset fra T7 til T10. Stop i rummet mellem T8 og T9 tornede fremspring. Skær væv mellem T8-T9 og T9-T10 med mikro saks.
    1. Brug rongeur at fjerne T9 proces. Expose krydset ved at skrabe forsigtigt musklen lag med mikro saks væk. Fortsæt, indtil knoglen er udsat for.
  8. Brug pincet til at fjerne muskler fra lamina og åbne en lille rum mellem hvirvlerne. Sæt forsigtigt mikro saks under knoglen, skære den tynde plade på begge sider, og fjern denne del med en pincet.
  9. Fjern lamina med forceps at blotlægge ledningen. Sørg for ikke at efterlade nogen gratis eller takkede knoglefragmenter bag; fjerne dem med rongeur.
  10. Brug lille spids pincet til at fjerne periosteum samt eventuelle knoglerester eller muskler, der kan være i nærheden af ​​snittet.
  11. Fjern det øverste halvdel af T9 dorsale processen og gå videre til IH Impactor enheden protokol.

5. IH Impactor Device Protocol (Blå mærker)

  1. Anbring musen midt stabilisering platform IH Impactor enheden.
  2. Bloker dyret med de to tænder pincet forbundet med stabilisering platform med to fælles positionering arme (venstre arm for brysthvirvel, højre arm for halshvirvel).
  3. Brug rostrale arm til at gribe den laterale kant af den rostrale hvirvellegeme (T8).
  4. Manipulere caudale arm på samme måde at gribe T10 hvirvellegemet.
  5. Placer stabilisering platform i enheden, og sænk spids (diameter 0,75mm) så tæt på ledningen som muligt uden at røre den.
  6. Løft spidsen tre hele omgange inden initiering virkningen.
  7. Udfør kontusion med slaglegemet indstillet til at levere en kraft på 60 kdyn ved 100 mm / sek.

6. Suturer og Post-pleje

  1. Suturere indsnit med en 4/0 absorberbar sutur tråd. Dæk udsatte rygmarven på stedet for fjernet lamina; suturere vævet ved yderpunkterne af snittet ved hjælp af en lille nål. Sæt de to masker umiddelbart over og under det sted rygmarven eksponering.
  2. Luk huden ved hjælp af to eller tre Reflex klip uden at klemme fra de underliggende muskler.
  3. Hydrat musen efter kirurgi med 2 ml saltopløsning injiceret subkutant i den nedre ryg.
  4. Placer musen tilbage i en forvarmet bur for at undgå hypotermi under kirurgisk opsving. Placer bure på varmepuder.
  5. Overvåg musene i den akutte fase efter skaden ved at kontrollerestørrelse blære, suturen og dyret vægt to gange dagligt. Forsigtigt presse blære (to gange dagligt i 7 dage) for at undgå urinvejene er infektioner (urin kunne være uklar, blodig eller indeholder bundfald).
  6. Behandl mus en gang dagligt med en saltopløsning injektion (2 ml i to dage efter kirurgi sc injektion) og antibiotika (gentamycin 0,2 ml; sc injektion) i fem dage efter skaden.
  7. Behandl mus for postoperativ analgesi med buprenorphin (0,1 mg / kg; to gange dagligt) i 3 dage efter skaden.

7. haleveneinjektion Celler

BEMÆRK: I det følgende trin er vist procedure for indsprøjtning af celler i halevenen. Celler kan også administreres med et intraspinal transplantation ved hjælp af en stereotaktisk ramme 15-16, eller i cisterna magna 17. Det er vigtigt at overveje, at andre celletyper kan transplanteres med denne metode, såsom mesenchymale stromaceller(f.eks knoglemarv mesenchymstamceller, adipøst afledte stamceller, fostervand celler). Desuden kan andre behandlingsmuligheder såsom nanopartikler injiceres via halevenen efter rygmarvsskade.

  1. Brug 70% ethanol og PBS til at rense nålen før brug. Håndter kanylen og sprøjten kun med sterile handsker.
  2. Resuspender cellerne i reagensglasset og belastning 75 pi celler i en 0,3 ml sprøjte (29 G kanyle og 0,33 cc sprøjte).
  3. Sørg for at ingen bobler i cellen suspension. Opbevar sprøjten i vandret stilling for at undgå celle sedimentation.
  4. Anbring musen under varmelampe til at spile halevenerne.
  5. Grib musen og træk det forsigtigt i musen harpiksstopperen at visualisere den laterale halevene som en smal blå linje.
  6. Rengør halen med en spritserviet. Når venen visualiseres, grab halevenen mellem den midterste finger og tommelfinger på venstre hånd.
  7. Bring nålen til overfladen ved en 15 ° vinkel fra horisonten og sørg facet er op.
  8. Injicer 50 pi celler med en hastighed på .33 pl / sek. Efter injektionen forsinke tilbagetrækningen af ​​nålen ved 10 sek. Træk nålen langsomt og være opmærksom på den mulige udstrømning af celle suspension.
  9. Rengør sprøjten som i trin 7.1 mellem belastninger.

8. Adfærdsmæssige Tests og Hind Limb Funktion

  1. Placer musen på åben mark.
  2. Vurdere bevægeapparatet funktion og bagben opsving efter kontusion med åben mark test i overensstemmelse med Basso musen skalaen (BMS) 18.
    BEMÆRK: Neurologisk funktion skal vurderes med jævne mellemrum, fra dag 3 efter skade i 4 uger 18.

9. Perfusion

  1. Ved afslutningen af ​​forsøgsperioden, bedøver dyr ved en intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (65 mg / kg). Brug tå kniber at evaluate anæstesi niveau og fortsætte, når musen ikke reagerer på de skadelige stimuli.
  2. Begrænse dyret i rygleje på en operation fly.
  3. Skær gennem integument og bugvæggen lige under brystkassen. Adskil membranen fra leveren.
  4. Brug saks til at klippe membranen for at blotlægge det pleurale hulrum.
  5. Skær siderne af brystkassen til kraven knogler.
  6. Brug hemostats at klemme den formet som et sværd brusk og placer arterieklemmen over hovedet.
  7. Hold nederste tredjedel af hjerte på en tværgående plan med pincet. Stik nålen ind i venstre ventrikel.
  8. Brug en hæmostat at klemme hjertet. Dette sikrer nålen og forhindrer lækage.
  9. Brug saks til at klippe det højre atrium.
  10. Lad PBS til pumpen (18 ml / min) gennem dyret. Oprethold dette tryk i hele buffer infusion periode (3-4 min, svarende til ca. 70 ml PBS). Fortsæt, indtil hjertet er rent.
  11. Skift stophanen at tillade fiksativ (4% paraformaldehyd i destilleret vand, 4% PFA) gennem pumpen. Lad 4% PFA at pumpe gennem dyret til ca. 8-10 min (300 ml). Gradvist øge presset for at nå et maksimum på 30 ml / min. En hærdet leveren er den bedste indikation af et vellykket perfusion.

10. Tissue Indsamling og behandling, Histologi og Iimmunohistochemistry

  1. Dissekere rygmarv fra T5 til L1. Derefter post-fix vævet i 6 ml i 4% PFA (O / N ved 4 ° C).
  2. Sæt det samme væv i en opløsning med 30% saccharose i 72 timer ved 4 ° C for at kryo beskytte det og for at forhindre dannelsen af ​​krystaller under frysning.
  3. Hurtig fryse ledningen ved hjælp af tøris og opbevar det ved -80 ° C.
  4. Afsnit ved hjælp af en kryostat med 15 um tykkelse og samle sektioner på objektglas og fortsætter immuncytokemi.
  5. Skyl sektioner med 200 pi PBS for hver sLiDE (3 gange, 5 minutter hver, stuetemperatur).
  6. Permeabilisere hver slide med 200 pi 10% NGS og 0,2% Triton X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Skyl afsnit med 200 pi PBS til hvert dias (3 gange, 5 min hver, RT).
  8. Blokere ikke-specifikke steder med 200 pi blokeringsopløsning til glideren (5% NGS, 0,1% Triton X-100 i PBS) i 30 minutter (RT).
  9. Inkuber hver slide med 200 pi primære antistoffer O / N ved 4 ° C (fortyndet antistof i 5% NGS, 0,1% Triton X-100 i PBS).
  10. Vask sektioner med 200 pi PBS for hvert dias (3 gange, 5 min hver; RT).
  11. Inkuber med passende sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur.
  12. Vask sektioner med 200 pi PBS for hvert dias (3 gange, 5 min hver; RT).
  13. Stain kerner med 200 pi 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml slutkoncentration, 10 min ved stuetemperatur).
  14. Monter ved hjælp af FluorSave reagens og analysere ved konfokal mikroskopi.
    BEMÆRK: Ikontrol bestemmelser, primære antistoffer skal udelades og erstattes med tilsvarende koncentrationer af uafhængige IgG af samme underklasse. Mikrotubulus-associeret protein 2 primære antistof blev anvendt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det samlede antal transplanterede celler er 1 x 10 6 celler og blev opdelt i tre på hinanden følgende injektioner i halevenen. Vi administreret 3,3 x 10 5 celler i 50 pi phosphatpufferopløsning (PBS). Den første injektion blev udført inden for 30 min efter skade, den anden 6 timer senere, og de sidste 18 timer efter læsionen. Valget af en frist på 18 timer efter SCI til administration PM-NPC'ere blev bestemt ved den optimale permeabilitet af blod-hjerne barrieren på dette tidspunkt 14. For at vurdere effekten af ​​stamceller injektion det ville være nyttigt at have en positiv kontrol laminectomies dyr (n = 14) og PBS injiceret dyr som en negativ kontrol (n = 14).

PM-NPC'ere forbedre inddrivelsen af Hind Limb Function, migrere til læsionsstedet og differentiere i MAP-2-positive celler

T9 kontusion forårsaget forbigående tab af bagben funktion efterfulgt af en progressiv gradual opsving (figur 1). Inden for 2-3 uger, PBS-behandlede sårede mus forbedret og bagben funktion nåede 3 point i BMS (svarende til plantar placering af poten med eller uden vægt support eller lejlighedsvis, hyppige, eller konsekvent dorsale stepping, men ikke plantar stepping 18) . I stedet inden for samme observationelle periode, sårede mus behandlet med PM-NPC'ere viste en højere opsving og nåede 4,5 point i BMS (svarende til hyppig eller konsekvent plantar stepping uden samordning, eller hyppig eller konsekvent plantar træde med en vis koordination). Den adfærdsmæssige forbedringer var særlig tydeligt i perioden mellem dag 7 og dag 14 efter SCI. Ingen tegn på allodyni-lignende forben hyper følsomhed 19 blev registreret på noget tidspunkt i enhver forsøgsgruppe hele observerende periode på 30 dage.

Mest indpodet PM-NPC, mærket med PKH26 (figur 2), akkumuleret ved kanterne aflæsion danner klynger (Figur 3) fra de tidlige dage af deres administration. Så de transplanterede celler migreret langs læsioner kanter og på en mere diffus måde, hvor de opdelte gradvist antager den asymmetriske cellulære konformation af neuroner. Ved 30 dage efter læsionen og transplantation, øget cellen organ PM-NPC i størrelse og i de fleste celler dendritiske-lignende processer var indlysende og fuldt immunfarvet med de specifikke antistoffer mod MAP-2 (figur 4). Opnåelsen af ​​morfologiske kompleksitet og positivitet til MAP2 ved transplanteret PM-NPC'ere sandsynligvis ikke skyldes fusion med overlevende vært rygmarvsneuroner, hvilket er tydeligt i deres klart adskilles morfologi og fraværet af to kerner i en enkelt mærket celle.

Figur 1
Figur 1. PM-NPC'ere forbedre funktionel RECOVery i tilskadekomne dyr. Den åbne felt bevægelse var ansat til bestemmelse af motorisk funktion recovery 18 test. Dyrene blev testet dagen før blodudtrædning og scorede 9 point i BMS skalaen. På den første dag efter skade i de læderede dyr, BMS score faldt til nul. Genopretningen af ​​bagbenet funktion læderede mus viste en bemærkelsesværdig og langvarig forbedring, når dyrene blev behandlet med PM-NPC'ere. Analysen blev udført i dobbelt blind, og hver gruppe bestod af 14 dyr. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. Vi bestemt statistiske forskelle ved hjælp af ANOVA-test efterfulgt af Tukey post-test. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.

Figur 2
Figur 2. PKH26 mærkning af PM-NPC'ere. Efter proceduren med PKH26 mærkning PMNPCS er visu alized med live-billedet mikroskop Evos fl og mikrofotografi blev taget med det samme instrument (skala bar = 50 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Lokalisering af PM-NPC i læsionsstedet. PKH26-mærket PM-NPC (rød) er til stede i hele kanterne af læsionsstedet på 30 dage efter deres iv injektion. Billedet er repræsentativ for 1 mus, men lignende billeder blev opnået i mindst 5 dyr (skala bar = 50 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

load / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Figur 4. MAP2 ekspression i transplanterede PM-NPC'ere. De fleste PKH26-mærket PM-NPC'ere (rød) erhvervet en neuronal-lignende form med dendritiske-lignende processer og havde differentieret MAP-2-positive celler (grøn). Kerner farves i blå (DAPI). Billedet er repræsentativ for 1 mus, men lignende billeder blev opnået i mindst 5 dyr (skala bar = 25 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir beskrev vi en metode til at opnå en reproducerbar model af traumatisk rygmarvsskade ved hjælp af en Infinite Horizon Impactor ved en kraft på 70 Kdyne (alvorlig). Ved hjælp af en større kraft paradigme (80 Kdyne), kan vi give en mere alvorlig skade, som desværre er forbundet med højere mus dødelighed. For at undgå dette problem, vi almindeligvis vælge en moderat kraft paradigme (70 Kdyne), der er knyttet til en gentagelig læsion med en gradvis genopretning af funktion og lavere dødelighed. For at producere en sådan stabil skade er det meget vigtigt at være særlig opmærksom på den korrekte fiksering af dyret i pendulets platform; især rygmarven skal være centreret på slaglegemet spids, og de to arme af slaglegemet skal være parallelle med hinanden. Desuden skal der tages hensyn til at blokere dyret med slaglegemet pincet, når hvirvlerne kan knuses, og ledningen kan blive beskadiget ved spidserne af pincet. Positioneringen af ​​animal efter laminektomi er kritisk, og håndtering af dyr i løbet af denne procedure er også meget vigtig. Skal også være særlig opmærksom på laminektomi procedure, som altid skal udføres på samme sted og med samme forlængelse. Når disse procedurer udføres under laminektomi, andet metodologisk problem at overvåge er reduktionen af ​​risikoen for at beskadige ledningen, når du bruger mikro-saks, rongeur eller pincet til at skære knogler og frigøre ledningen gennem fjernelse af lamina, at fjerne resterende laterale knogle fremspring og fragmenter og fjerne periosteum. Brugen af ​​mikro-saks og rongeur med tips opad vil mindske risikoen for at støde på de ovennævnte problemer.

En vigtig begrænsning ved denne fremgangsmåde er den høje sandsynlighed for, at dyrene kan udvikle interne og eksterne alvorlige urinvejsinfektioner i post skade. Den eksterne infektion skyldes den manglende evne af de læderede mus move med bagbenet vægt support. I modsætning hertil kan den interne urinvejsinfektion være forårsaget af manglende evne til de skadelidte mus til at tisse selvstændigt. For at undgå disse problemer er det absolut nødvendigt at injicere dyrene med den angivne antibiotikum og at kontrollere størrelsen af ​​blæren to gange om dagen i løbet af de procedurer den første uge dyreplejepraksis. Hydreringsstatus og vægten skal kontrolleres omhyggeligt i de første tre uger efter læsionsdannelsen.

Anvendelse de beskrevne procedurer, vi var i stand til at opnå reproducerbare underskud i bagbenet funktion, der blev evalueret gennem en særlig adfærdsmæssige test udviklet af Basso og kolleger (BMS) 18. Umiddelbart efter skaden bagbenet tab af funktion er færdig, som efterfølges af et gradvist opsving, der er vigtigst i de første 2-3 uger. Den adfærdsmæssige genopretning nået et højere niveau, når læderede mus blev behandlet med voksne PM-NPC (figur 1 (figur 3). Vi skønnede, at det samlede antal vital podet PM-NPC'ere er større end de podede økonomiske og sociale råd og voksne NSC som tidligere rapporteret af vores forskergruppe 20-21. Fire uger efter læsionsdannelsen og transplantation fleste PM-NPC har større organer og har udvidet dendritiske-lignende processer, der er fuldt immunofarvede af specifikke antistoffer til MAP-2 (figur 4).

Den største fordel ved denne model af traumatisk rygmarvsskade er standardisering af skaden. En reproducerbar tidsrelateret kurve bagbenet genvinding af funktion opnås også. En sådan reproducerbarhed gør det muligt at definere proof-of-principle undersøgelser for undersøgte behandlinger, herunder transplantation af celler til regenerativ medicin studies med et reduceret antal tilfælde. Desuden kan flere aspekter af patofysiologien af ​​rygmarvsskade analyseres nærmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Tags

Medicine rygmarvsskade neurale forstadier celler stamceller transplantation halevenen celle injektion dyrs adfærd inflammation
Neural stamcelletransplantation i Eksperimentel Contusive Model for Rygmarvsskader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace,… More

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter