Summary
A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.
Abstract
A lesão medular é uma condição clínica devastadora, caracterizada por um complexo de disfunções neurológicas. Os modelos animais de lesão da medula espinal pode ser utilizado tanto para investigar as respostas biológicas a lesões e para testar terapias potenciais. Contusão ou compressão lesão entregue à medula espinal exposta cirurgicamente são os modelos mais amplamente utilizados de patologia. Neste relatório, a contusão experimental é realizada utilizando o dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite a criação de um modelo animal lesão reprodutível através da definição de parâmetros de lesão específica. O transplante de células-tronco é comumente considerado uma estratégia potencialmente útil para a cura desta doença debilitante. Numerosos estudos têm avaliado os efeitos do transplante de uma variedade de células estaminais. Aqui demonstramos um método adaptado para lesão da medula espinal, seguido por injecção na veia da cauda de células em ratos CD1. Em suma, nós fornecemos procedimentos para: i) marcação celular with um traçador vital, ii) o atendimento pré-operatório de ratos, iii) execução de uma lesão medular contundente, e iv) a administração intravenosa de pós mortem precursores neurais. Este modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia e segurança de transplante de células estaminais em uma abordagem de medicina regenerativa.
Introduction
A lesão medular (LM) é a lesão mais comum causada por trauma de alta energia, como veículos automóveis acidentes, quedas, esportes e violência 1. Em grave SCI, a força lesão destrói ou danifica o tecido neural, causando perda súbita da função neurológica. Traumatic SCI ocorre frequentemente em adultos jovens entre 10 e 40 anos de idade. Ela afeta grandemente condição mental e física do paciente e causa enorme impacto econômico para a sociedade 2. A abordagem de tratamento na fase aguda é geralmente limitada a uma alta dose de corticosteróide, a estabilização cirúrgica e descompressão para possivelmente atenuar danos maiores 3-4, mas os papéis desses métodos na recuperação locomotora após SCI ainda são controversos. Além da perda de tecido aguda, lesão traumática e a activação de mecanismos secundários de degeneração causa desmielinização e morte de vários tipos de células 5-6. O grau de recuperação da função pode dedez ser correlacionado com a extensão da matéria branca poupado no local da lesão 7.
Os modelos animais de SCI pode ser usado tanto para investigar as respostas biológicas do tecido a lesão e para testar terapias potenciais. Além disso, um modelo animal útil de uma patologia humana, não só tem que reproduzem alguns aspectos dessa condição, mas deve também oferecer vantagens sobre observação clínica directa e experimento. Os modelos mais amplamente utilizados de lesão da medula espinal ou contusão envolvem compressão lesão entregue para a medula espinal exposta cirurgicamente 8. O desenvolvimento de uma contusão peso-drop controlados representam um marco importante na história da pesquisa SCI. O centro de pesquisa medula espinhal Ohio State University tem prosseguido o desafio tecnológico de um dispositivo que pode ser usado para induzir uma compressão particular da medula espinal com parâmetros de impacto controlado por um computador 9. Esta foi originalmente projetado para uso with ratos; mais tarde foi modificado para aplicar em direção camundongos 10. As vantagens deste tipo de abordagem é que a biomecânica da lesão pode ser estudado com mais profundidade e os parâmetros de lesão pode ser definida de uma maneira mais completa, a fim de obter um modelo experimental reproduzível, portanto, permitindo uma avaliação mais precisa dos efeitos de tratamentos testados sobre o processo de recuperação funcional.
Muitos estudos avaliaram os efeitos de transplante de uma variedade de células-tronco em modelos SCI 11. Temos recentemente isolado adultos neural células-tronco a partir da Sub-Ventricular Zone (SVZ) várias horas após a morte do doador do mouse 12-13. Este procedimento proporciona uma população de células-tronco neurais, chamado post mortem precursores neurais (PM-NPCs), que parecem ser vantajoso em uma abordagem da medicina regenerativa para curar SCI. Neste artigo vamos demonstrar: i) o protocolo de marcação celular com o PKH26 tracer vital, ii) o surgical procedimento para executar em SCI traumático, e iii) a administração intravenosa (iv) administração de células marcadas. Além disso, neste trabalho demonstram que as células transplantadas migrar para locais de lesão da medula espinhal e diferenciar principalmente em proteína associada microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Além disso, a diferenciação é acompanhada pela promoção de uma recuperação estável da função dos membros posteriores.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão da Universidade de Milão e se encontrou com as Diretrizes italianos para Animais de Laboratório em conformidade com a Directiva Europeia Comunidades datado de Novembro de 1986 (86/609 / CEE).
1. Preparação de células para transplantes
NOTA: Use as células-tronco neurais entre os dias 5 e 9 passagem em cultura para estas experiências; testar as culturas para a proliferação e diferenciação capacidade antes de serem rotulados para transplante. Determinar a extensão de diferenciação de 12 por imunocitoquímica.
- Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 6 células / 150 uL (transplante 1 x 10 6 culas por ratinho). Preparar pelo menos 1,2 x 10 6 culas por rato por causa de um excesso de células é necessária para fins de carregamento seringa.
- Lave as células 3 vezes com o meio de células-tronco neurais 13 em um frasco de 10 ml cônico. Em cadapasso de lavagem, as células precipitadas por centrifugação (500 xg durante 5 min, RT).
- Contar as células antes da rodada final.
- Centrifuga-se as células (500 xg durante 5 min), e, em seguida, aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não remover todas as células, mas não deixando mais do que 25 ul de sobrenadante.
- Prepara-se uma suspensão de células de 2 x por adição de 1 ml de diluente de C para a pelete de células e ressuspender com pipetagem suave.
- Imediatamente antes da coloração, preparar uma solução 2x da tintura (4 x 10-6 M) em Diluente C por adição de 4 ul de solução de corante etanol PKH26 para 1 ml de diluente de C em um tubo e misturar para dispersar bem.
- Rapidamente adicionar os 1 ml de suspensão de células para 2 x 1 ml de 2x solução de corante e misturar imediatamente a amostra, pipetando (densidade celular final será 1,2 x 10 7 células / ml e 2 x 10-6 M PKH26).
- Incubar a suspensão de células / corante durante 1-5 minutos.
- Pare a coloração por adição de um volume igual (2ml) de solução de BSA a 1% em HBSS e incubar durante 1 min.
- Células de centrifugação (500 xg por 10 min) e cuidadosamente remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de HBSS e centrifugação (500 xg durante 5 min).
- Lava-se a pelete de células mais duas vezes com 10 ml de meio completo para assegurar a remoção de corante não ligado.
- Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio completo para a avaliação da recuperação das células, viabilidade celular e a intensidade de fluorescência. Se forem necessárias para o transplante de células, lavar e ressuspender-los numa solução fisiológica estéril a uma concentração de 3,3 x 10 5 células / 50 ul.
2. Preparação para Cirurgia
- Equipamentos de cirurgia limpar e esterilizar.
- Prepare a área de cirurgia, limpando com um agente asséptico. Configure o dispositivo IH do pêndulo.
- Prepare o aparelho de anestesia: o Scavenger gás ativo com Filtro VetScav Pesando dispositivo, fluxo contínuo de indução Câmara, Gene Oxygenrator, Low Flow O 2 Medidor por Mice. Limpe a câmara de indução e a máscara usada durante a cirurgia.
- Anestesiar os animais com 2,5% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min), e esperar 5 min após a indução de fluxo para o medicamento tenha efeito. Verifique se os bigodes estão se contraindo ou se houver a retirada do membro posterior lento em resposta a beliscar a pata. Durante a cirurgia, reduzir a concentração de isoflurano a 2,0% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min).
3. Preparação de Ratos de Cirurgia e Transplante
- Mantenha o CD1 camundongos adultos do sexo masculino (25-30 g) por pelo menos 3 dias antes dos experimentos em condições normais (22 ± 2 ° C, 65% de umidade e luz artificial entre 08h00 - 20:00).
NOTA: Todo o processo de preparo cirúrgico para sutura levará cerca de 40 min.- Para identificar o animal, marcar a cauda por meio de tinta colorida resistente à água.
- Use um electric clipper para cortar o cabelo dorsal do rato a partir do pescoço, sobre a nível T2, a região lombar.
- Esterilizar a área preparada com uma solução de iodeto e de etanol (70% em água estéril).
- Tratar o animal com uma sub cutânea (sc) de injecção de 200 uL de gentamicina (1 mg / ml em solução salina estéril).
- Aplicar lubrificante oftalmológico em ambos os olhos dos animais para prevenir a dessecação e injectar buprenorfina (por via subcutânea, 0,03 mg / kg) para aliviar a dor.
4. Laminectomy
- Posicione o mouse sobre um aquecedor de slides para evitar o problema de hipotermia durante a cirurgia. Posicione o animal com o dorsal para cima.
- Adicione uma incisão vertical com um bisturi ao longo da região de interesse, a partir de T7 a T12.
- Mantenha a pele ea almofada de gordura superficial usando fórceps convencionais (normalmente encontrada no espaço entre a 5 e 6 de processos torácica dorsal).
- Contar o processo sob o vaso como T6em seguida, passar a T7.
- Coloque um pouco rolamento sob o lado ventral do ratinho para aumentar a curvatura da coluna vertebral. Imobilizar a medula espinhal, bloqueando-o com a pinça Graefe.
- Corte os músculos paravertebrais bilateral de T7 e T10 nível vertebral usando o bisturi até que a superfície dorsal dos contactos a ponta da lâmina de bisturi.
- Use o bisturi para assinalar fora da junção de T7 até T10. Pare no espaço entre T8 e T9 saliências espinhosas. Cortar os tecidos entre T8-T9 e T9-T10 com as micro tesoura.
- Use a Rongeur para remover o processo T9. Exponha a junção com cuidado raspar a camada muscular com os micro tesoura. Continue até que o osso é exposto.
- Utilizar as pinças para remover músculos da lâmina e abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Insira com cuidado as micro tesoura sob o osso, corte a lâmina em ambos os lados e remover esta parte com uma pinça.
- Retire a lâmina com a forceps para expor o cabo. Cuidado para não deixar quaisquer fragmentos de ossos gratuitos ou irregulares para trás; removê-los com o Rongeur.
- Use as pequenas pinças ponta para remover o periósteo bem como quaisquer fragmentos de ossos ou músculos que pode estar próximo da incisão.
- Remova a metade superior do processo dorsal T9 e prosseguir com o protocolo dispositivo IH do pêndulo.
5. IH Impactor Dispositivo Protocol (contusão)
- Colocar o rato no meio da plataforma do dispositivo de estabilização IH Impactor.
- Bloqueie o animal com as duas pinças de dentes relacionados com a plataforma de estabilização por dois braços de posicionamento articular (braço esquerdo para a vértebra torácica, o braço direito para vértebra cervical).
- Use o braço rostral para segurar a borda lateral do corpo vertebral rostral (T8).
- Manipular o braço caudal da mesma maneira de entender o corpo vertebral T10.
- Coloque a plataforma de estabilização no dispositivo e diminuir a ponta (diâmetro 0,75mm) mais próximo possível do cabo quanto possível, sem tocá-lo.
- Levante a ponta três voltas completas antes de iniciar o impacto.
- Realize a contusão com o pêndulo definido para entregar uma força de 60 kdyn a 100 mm / s.
6. suturas e pós-atendimento
- Suturar a incisão com um 4/0 absorvível fio de sutura. Cobrir a medula espinal exposta no local da lâmina removida; suturar o tecido nas extremidades do corte por meio de uma pequena agulha. Colocar os dois pontos imediatamente acima e abaixo do local de exposição da medula espinal.
- Feche a pele usando dois ou três clipes Reflex sem beliscar fora os músculos subjacentes.
- Hidrate o mouse pós-cirurgia com 2 ml de solução salina subcutânea na região lombar.
- Posicione o mouse de volta em uma gaiola pré-aquecido para evitar hipotermia durante a recuperação cirúrgica. Coloque as gaiolas em almofadas de aquecimento.
- Monitorar os ratos durante a fase aguda pós-lesão, verificando atamanho da bexiga, o fio de sutura e o peso do animal, duas vezes por dia. Aperte delicadamente bexiga (duas vezes por dia durante 7 dias) para evitar infecções (urina poderia ser nublado, com sangue ou que contenham quaisquer precipitados) do trato urinário.
- Tratar os ratos uma vez por dia com uma injecção de solução salina (2 mL durante dois dias pós-cirurgia de injecção sc) e antibiótico gentamicina (0,2 mL; injecção sc) durante cinco dias após a lesão.
- Tratar os ratos para analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,1 mg / kg, duas vezes por dia) durante 3 dias após a lesão.
7. Cauda Vein injeção de células
NOTA: Para o passo seguinte do processo para injectar as células na veia da cauda é demonstrada. As células podem ser também administrada com um transplante de intraspinal usando um quadro estereotáxico 15-16, ou na cisterna magna 17. É importante considerar que outros tipos de células podem ser transplantadas com este método, tais como as células estromais mesenquimatosas(por exemplo, da medula óssea, células-tronco mesenquimais derivadas de células-tronco adiposas, células do líquido amniótico). Além disso, outras opções de tratamento, tais como as nanopartículas podem ser injectados através da veia da cauda após a lesão da medula espinal.
- Use etanol a 70% e PBS para limpar a agulha antes da utilização. Lidar com a agulha e seringa apenas com luvas estéreis.
- Ressuspender as células em tubos de ensaio e de carga de 75 ul de células dentro de uma seringa de 0,3 ml (29 L agulha e seringa 0,33 cc).
- Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da suspensão celular. Manter a seringa na posição horizontal para evitar a sedimentação de células.
- Posicione o mouse sob a lâmpada de calor para dilatar as veias da cauda.
- Pegue o mouse e puxe-o na restrainer mouse para visualizar a veia lateral da cauda como uma linha azul estreita.
- Limpe a cauda com um algodão embebido em álcool. Uma vez que a veia é visualizado, pegue na veia da cauda entre o polegar eo dedo médio da mão esquerda.
- Traga a agulha para a superfície em um ângulo de 15 ° a partir do horizonte e certifique-se o bisel é para cima.
- Injectar 50 jil de células, a uma taxa de 0,33 l / seg. Após a injecção, atrasar a retracção da agulha por 10 seg. Retirar a agulha devagar e preste atenção para a possível efluxo de suspensão de células.
- Limpe a seringa como no passo 7.1 entre as cargas.
8. Testes comportamentais e Função Hind Limb
- Posicione o mouse no campo aberto.
- Avaliar a função locomotora e recuperação dos membros posteriores após contusão com o teste de campo aberto de acordo com a escala do mouse Basso (BMS) 18.
NOTA: A função neurológica deve ser avaliada periodicamente, a partir do dia 3 após a lesão durante 4 semanas 18.
9. Perfusão
- No final do período experimental, anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (65 mg / kg). Use pitadas toe para Avaliado come o nível de anestesia e prosseguir apenas depois do mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.
- Contenha o animal em decúbito dorsal em um avião cirurgia.
- Corte através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Separa-se a membrana a partir do fígado.
- Use a tesoura para cortar o diafragma para expor a cavidade pleural.
- Cortar os lados da caixa torácica até que os ossos da clavícula.
- Use os hemostats para prender a cartilagem xifóide e colocar a pinça hemostática sobre a cabeça.
- Segure o terço inferior do coração em um plano transversal com a pinça. Insira a agulha para o ventrículo esquerdo.
- Utilize uma pinça hemostática para prender o coração. Isto assegura que a agulha e impede a fuga.
- Use a tesoura para cortar o átrio direito.
- Permitir que o PBS para bombear (18 ml / min) através do animal. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão (3-4 min; correspondente a cerca de 70 ml de PBS). Continue até que o coração é limpo.
- Alternar a torneira para permitir que o fixador (4% de paraformaldeído em água destilada, PFA a 4%) através da bomba. Permitir que o PFA a 4% para bombear através do animal durante cerca de 8-10 min (300 ml). Aumentar gradualmente a pressão até atingir um máximo de 30 ml / min. Um fígado endurecido é a melhor indicação de uma perfusão de sucesso.
10. Tissue recolha e processamento, Histologia e Iimmunohistochemistry
- Dissecar medulas espinhais de T5 a L1. Em seguida, pós-fixar o tecido em 6 ml em 4% PFA (O / N a 4 ° C).
- Coloque o mesmo tecido em uma solução com 30% de sacarose durante 72 horas a 4 ° C, a fim de protegê-lo e crio para impedir a formação de cristais durante o congelamento.
- Resfriamento rápido o cabo usando gelo seco e armazená-lo a -80 ° C.
- Secção por meio de um criostato com 15 mm de espessura e recolher secções sobre lâminas de vidro e continuar para imunocitoquímica.
- Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 minutos cada, temperatura ambiente).
- Permeabilizar cada lâmina com 200 ul de 10% NGS e 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA.
- Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 min cada, RT).
- Bloquear os sítios não específicos com 200 ul de solução para a corrediça de bloqueio (5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min (RT).
- Incubar cada lâmina com 200 ul de anticorpos primários O / N a 4 ° C (anticorpo diluído em 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS).
- Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT).
- Incubar com anticorpos secundários apropriados durante 2 horas à TA.
- Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT).
- Stain núcleos com 200 ul de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentração final, 10 minutos à temperatura ambiente).
- Montar usando o Reagente FluorSave e analisar por microscopia confocal.
NOTA: Emdeterminações de controlo, anticorpos primários deve ser omitida e substituída com concentrações equivalentes de IgG não relacionados da mesma subclasse. Foi utilizada associada a microtúbulos Protein 2 anticorpo primário.
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Representative Results
O número total de células transplantadas é 1 x 10 6 células e foi dividido em três injecções consecutivas na veia da cauda. Nós administrado 3,3 x 10 5 células em 50 ul de solução tampão de fosfato (PBS). A primeira injecção foi realizada no prazo de 30 minutos após a lesão, o segundo 6 horas mais tarde e as últimas 18 horas após a lesão. A escolha de um limite de tempo de 18 horas após a administração de SCI para PM-NPCs foi determinada pela permeabilidade óptima da barreira hemato-encefálica em 14 este tempo. Para avaliar o efeito da injecção de células estaminais seria útil ter positivos laminotomias os animais de controlo (n = 14) e injectados com PBS animais como um controlo negativo (n = 14).
PM-NPCs Melhorar a recuperação da função Hind Limb, migrar para o local da lesão e se diferenciar em MAP-2 células positivas
A contusão T9 causou a perda transitória da função do membro posterior seguido por um g progressivarecuperação radual (Figura 1). Dentro de 2-3 semanas, os ratos lesionados tratados com PBS melhorado e função dos membros posteriores chegou a 3 pontos de BMS (correspondente a colocação plantar da pata com ou sem suporte de peso ou ocasional, freqüente, ou consistente stepping dorsal, mas não plantar pisar 18) . Em vez disso, dentro do mesmo período de observação, os ratos lesionados tratados com PM-NPCs mostrou uma recuperação maior, chegando a 4,5 pontos de BMS (correspondente a stepping plantar frequente ou consistente, sem coordenação, ou plantar freqüente, ou consistente pisando com um pouco de coordenação). A melhoria comportamental foi particularmente evidente no período de 7 dias e 14 dias após a LM. Sem sinais de membro anterior alodinia-like hiper sensibilidade 19 foram registrados em qualquer momento em qualquer grupo experimental durante todo o período de observação de 30 dias.
Mais enxertada PM-NPCs, marcado com PKH26 (Figura 2), acumula nas bordas dalesão formando grupos (Figura 3) desde os primeiros dias de sua administração. Em seguida, as células transplantadas migraram ao longo das bordas da lesão e de uma forma mais difundida onde diferenciadas, assumindo gradualmente a conformação assimétrica celular dos neurónios. Aos 30 dias após a lesão e o transplante, o corpo da célula de PM-NPCs aumentou em tamanho e na maioria das células dendríticas processos semelhantes foram evidentes e totalmente imunocoradas pelos anticorpos específicos para MAP-2 (Figura 4). A realização de complexidade morfológica e da positividade para MAP2 por transplantado PM-NPCs não é provável devido à fusão com sobrevivendo hospedeiras neurônios da medula espinhal, o que é evidente na sua morfologia claramente diferenciados e da ausência de dois núcleos em um único celular rotulados.
Figura 1. PM-NPCs melhorar RECOV funcionalEry em animais feridos. A locomoção campo aberto foi o teste empregado para a determinação de retorno da função motora 18. Os animais foram testados no dia anterior a contusão e marcou 9 pontos na escala BMS. No primeiro dia pós-lesão nos animais lesionados, a pontuação BMS diminuiu para zero. A recuperação da função dos membros posteriores de ratos lesionados apresentaram uma melhora duradoura notável e muito tempo, quando os animais foram tratados com PM-NPCs. A análise foi realizada em dupla ocultação, e cada grupo foi composto por 14 animais. Os valores representam média ± SEM. Nós determinamos as diferenças estatísticas por meio de análise de variância seguida do pós-teste de Tukey. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.
Figura 2. PKH26 rotulagem dos PM-NPCs. Após o procedimento de marcação com PKH26, PMNPCS são visu desmineralizada com o microscópio de imagem ao vivo Evos fl e microfotografia foi tirada com o mesmo instrumento (escala bar = 50 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Localização da PM-NPCs no local da lesão PKH26 marcado PM-NPCs (vermelho) estão presentes em todas as bordas do local da lesão em 30 dias após a sua injeção iv.. A imagem é representativo para um rato, mas imagens semelhantes foram obtidos por pelo menos 5 animais (barra de escala = 50 m). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. expressão MAP2 em transplantado PM-NPCs. A maioria PKH26 marcado PM-NPCs (vermelho) adquiriu uma forma neuronal-like com processos dendríticos-like e tinha diferenciado MAP-2 células positivas (verde). Os núcleos são corados em azul (DAPI). A imagem é representativo para um rato, mas imagens semelhantes foram obtidos por pelo menos 5 animais (barra de escala = 25 m). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo é descrito um método para obter um modelo reprodutível de lesão medular traumática usando um Infinito Horizon Impactor com uma força de 70 Kdyne (grave). Usando um paradigma força maior (80 Kdyne), que pode causar uma lesão mais grave que, infelizmente, está associado à mortalidade camundongos mais elevados. Para evitar esse problema, é comumente escolher um paradigma força moderada (70 Kdyne) que está associado a uma lesão repetíveis com uma recuperação gradual da função e menor mortalidade. Para produzir uma lesão tão estável, é muito importante que se preste especial atenção à fixação correta do animal na plataforma pêndulo; em particular, a medula espinhal deve ser centrado na ponta do pêndulo, e os dois braços do pêndulo devem ser paralelos um ao outro. Além disso, a atenção deve ser tomado em bloquear o animal com a pinça do impactador, quando as vértebras pode ser esmagado e o fio pode ser danificado pelas pontas das pinças. O posicionamento da animal após a laminectomia é crítico, e o manuseio dos animais durante este processo também é muito importante. Também deve ser dada especial atenção ao processo de laminectomia, que deve ser realizada sempre no mesmo local e pela mesma extensão. Quando estes procedimentos são realizados durante a laminectomia, outra questão metodológica para monitorar é a redução do risco de danificar o cabo ao usar micro-tesoura, Rongeur, ou pinça para cortar ossos e libertar o cabo através da remoção da lâmina, para eliminar o remanescente saliências ósseas laterais e fragmentos, e para remover o periósteo. O uso de micro-tesouras e Rongeur com pontas voltadas para cima irá reduzir o risco de se deparar com os problemas acima mencionados.
Uma limitação importante deste método é a alta probabilidade de que os animais podem desenvolver infecções urinárias graves internos e externos no período pós lesão. A infecção externo é devido à incapacidade dos ratinhos lesionados a move com suporte de peso dos membros posteriores. Em contraste, a infecção urinária interno pode ser causado pela incapacidade dos ratinhos lesionados de urinar de forma independente. A fim de evitar estes problemas, é absolutamente necessário para injectar os animais com o antibiótico indicado e para verificar o tamanho da bexiga duas vezes por dia durante os procedimentos de cuidados animais da primeira semana. O estado de hidratação e o peso deve ser verificado com cuidado durante as três primeiras semanas após a lesão.
Aplicando os procedimentos descritos, fomos capazes de obter déficits reprodutíveis da função dos membros posteriores que foram avaliados através de um teste comportamental específico desenvolvido pela Basso e colegas (BMS) 18. Imediatamente após a lesão, a perda da função de membro posterior está completa, que é seguida por uma recuperação gradual que é mais importante durante as primeiras 2-3 semanas. A recuperação comportamental atingiu um nível superior quando os ratinhos foram tratados com lesionados adulto PM-NPCs (Figura 1 (Figura 3). Estimou-se que o número total de vital enxertado PM-NPCs é maior do que os CES enxertados e NSC adultos como relatados anteriormente por nosso grupo de pesquisa 20-21. Às quatro semanas após a lesão e transplante, a maioria PM-NPCs têm corpos maiores e possuem alargada processos dendríticos semelhantes que são totalmente imunomarcadas pelos anticorpos específicos para MAP-2 (Figura 4).
A grande vantagem deste modelo de lesão medular traumática é a padronização da lesão. A curva relacionada ao tempo reprodutível de recuperação dos membros posteriores de função também é alcançado. Tal reprodutibilidade torna possível definir estudos de prova de princípio para tratamentos investigados, incluindo transplante de células para a medicina regenerativa studies com um número reduzido de casos. Além disso, vários aspectos da patof isiologia da lesão da medula espinal pode ser analisado em maior detalhe.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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