Summary
Ryggmärgsskada är en traumatisk tillstånd som orsakar svår sjuklighet och hög dödlighet. I detta arbete har vi i detalj beskriva en kontusion modell av ryggmärgsskada hos möss följt av en transplantation av neurala stamceller.
Abstract
Ryggmärgsskada är en förödande kliniska tillstånd, som kännetecknas av ett komplex av neurologiska dysfunktioner. Djurmodeller av ryggmärgsskada kan användas både för att undersöka de biologiska svar på skada och för att testa potentiella behandlingar. Kontusion eller kompressionsskada levereras till den kirurgiskt exponerade ryggmärgen är de mest använda modellerna av patologin. I denna rapport den experimentella kontusion utförs med hjälp av oändliga Horizon (IH) Impactor enhet, vilket möjliggör skapandet av en reproducerbar skada djurmodell genom definition av specifika skadeparametrar. Stamcellstransplantation är allmänt betraktas som en potentiellt användbar strategi för att bota detta försvagande tillstånd. Talrika studier har utvärderat effekterna av transplantera en mängd av stamceller. Här kan vi visa en anpassad metod för ryggmärgsskada följt av injektion i svansvenen av celler i CD 1-möss. Kort sagt, vi ger rutiner för: i) cellmärkning with en viktig spårämne, ii) preoperativ vård av möss, iii) genomförande av en Contusive ryggmärgsskada, och iv) intravenös administrering av obduktions neurala prekursorer. Denna kontusion modellen kan användas för att utvärdera effekt och säkerhet av stamcellstransplantation i en regenerativ medicin tillvägagångssätt.
Introduction
En ryggmärgsskada (SCI) är den vanligaste skadan som orsakas av hög energi trauma som motorfordon olyckor, faller, sport och våld 1. Vid svår SCI, förstör skadan kraften eller skadestånd nervvävnad, vilket orsakar plötslig förlust av neurologisk funktion. Traumatisk SCI förekommer ofta i unga vuxna mellan 10 och 40 års ålder. Det påverkar i hög grad patientens psykiska och fysiska tillstånd och orsakar enorma ekonomiska konsekvenserna för samhället 2. Den behandlingsform i det akuta skedet är ofta begränsad till en hög dos av kortikosteroid, kirurgisk stabilisering och dekompression att eventuellt dämpa ytterligare skador 3-4, men de roller dessa metoder på rörelse återhämtning efter SCI är fortfarande kontroversiell. Förutom akut vävnadsförlust, den traumatiska skador och aktivering av sekundära mekanismer av degeneration orsakar demyelinisering och död av flera celltyper 5-6. Graden av återhämtning av funktionen kan avtio korreleras till omfattningen av skonas vita substansen vid skada plats 7.
Djurmodeller av SCI kan användas både för att undersöka de biologiska svaren från vävnaden till skada och att testa potentiella behandlingar. Dessutom har en användbar djurmodell av en mänsklig patologi inte bara att återge vissa aspekter av detta villkor, utan även måste erbjuda fördelar jämfört direkt klinisk observation och experiment. De mest använda modeller av ryggmärgsskada involverar kontusion eller kompressionsskada levereras till kirurgiskt exponerade ryggmärgen 8. Utvecklingen av en kontrollerad vikt-släpp kontusion skada utgör en viktig milstolpe i historien om SCI forskningen. Ohio State University ryggmärg forskningscentrum har bedrivit den tekniska utmaningen av en anordning som kan användas för att framkalla en viss kompression av ryggmärgen med parametrar för påverkan styrs av en dator 9. Detta var ursprungligen avsedd för användning with råttor; senare modifierades att gälla mot möss 10. Fördelarna med denna typ av metod är att biomekanik skada kan studeras mer ingående och parametrarna för skada kan definieras på ett mer fullständigt sätt i syfte att erhålla ett reproducerbart experimentell modell, därför tillåta mer exakt bedömning av effekterna av testade behandlingar på den funktionella återhämtningen.
Många studier har utvärderat transplantations effekterna av en mängd olika stamceller i SCI-modeller 11. Vi har nyligen isolerade vuxna neurala stamceller från Sub-ventrikulära zonen (SVZ) flera timmar efter döden av musen donator 12-13. Detta förfarande ger en population av neurala stamceller, kallad post mortem neurala prekursorer (PM-NPC), som tycks vara fördelaktigt i en regenerativ medicin metod för att bota SCI. I denna uppsats kommer vi att demonstrera: i) protokoll för cellmärkning med den vitala spårämnet PKH26, ii) surgical förfarande för att utföra på traumatisk SCI, och iii) intravenös (iv) administrering av märkta celler. Dessutom i detta arbete visar vi att transplanterade celler migrerar till ryggmärgsskada platser och differentiera mestadels i mikrotubuli associerat protein (MAP) 2 positiva celler. Vidare är differentieringen åtföljs av främjande av en stabil återhämtning av bakbensfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden godkändes av granskningskommittén vid universitetet i Milano och träffade de italienska Riktlinjer för försöksdjur i enlighet med EU-direktivet gemenskaperna från november 1986 (86/609 / EEG).
1. Beredning av celler för transplantation
OBS: Använd neurala stamceller mellan den 5: e och 9: e passage i kultur för dessa experiment; testa kulturerna för proliferation och differentiering förmåga innan de märkta för transplantation. Fastställa omfattningen av differentiering genom immuncytokemi 12.
- Resuspendera celler till en koncentration av 1 x 10 6 celler / 150 | il (transplantation 1 x 10 6 celler per mus). Bered minst 1,2 x 10 6 celler per mus, eftersom ett överskott av celler krävs för sprutlastningsändamål.
- Tvätta cellerna tre gånger med användning av neurala stamcellmedium 13 i en 10 ml konisk flaska. I varjetvättsteg, fällning cellerna genom centrifugering (500 x g under 5 min, RT).
- Räkna celler innan den slutliga spinn.
- Centrifugera cellerna (500 xg under 5 minuter), och sedan aspirera supernatanten, försiktigt så att inte avlägsna eventuella celler men lämnar inte mer än 25 pl supernatant.
- Bered en 2x cellsuspension genom att tillsätta 1 ml spädningsmedel C till cellpelleten och återsuspendera med försiktig pipettering.
- Omedelbart före färgning, förbereda en 2x Dye Solution (4 x 10-6 M) i spädningsmedel C genom att tillsätta 4 pl av PKH26 etanolfärgämneslösning till 1 ml spädningsmedel C i ett rör och blanda väl för att skingra.
- Snabbt lägga till en ml av 2x cellsuspension till en ml 2x färgämneslösning och omedelbart blanda provet genom att pipettera (slutlig celltäthet kommer att vara 1,2 x 10 7 celler / ml och 2 x 10-6 M PKH26).
- Inkubera cell / färgämnessuspension för 1-5 minuter.
- Stoppa färgning genom tillsats av en lika stor volym (2ml) av 1% BSA-lösning i HBSS och inkubera i 1 min.
- Centrifugera cellerna (500 xg för 10 min) och ta försiktigt bort supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml HBSS och centrifugera (500 xg under 5 min).
- Tvätta cellpelleten två gånger med 10 ml av komplett medium för att säkerställa avlägsnande av obundet färgämne.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml komplett medium för utvärdering av cellåtervinning, cellviabilitet och fluorescensintensitet. Om celler behövs för transplantation, tvätta och återsuspendera dem i en steril fysiologisk lösning vid en koncentration av 3,3 x 10 5 celler / 50 | il.
2. Förberedelse för kirurgi
- Rengör och sterilisera kirurgisk utrustning.
- Förbered kirurgi området genom att torka med en aseptisk agent. Konfigurera IH Impactor enheten.
- Förbered anestesiapparater: Active Gas Scavenger med VetScav Filter Vägning Device, kontinuerligt flöde Induktion avdelningen, Oxygen Generator, Low Flow O2 Meter för möss. Rengör induktionskammare och masken används under operation.
- Söva djuren med 2,5% (v / v) isofluran i syre (1 L / min), och vänta 5 min efter flödes induktion för drogen ska börja gälla. Kontrollera om whiskers ryckningar eller om det är långsam bakbenen tillbakadragande som svar på nypa trampdynan. Under operationen, reducera isofluran koncentrationen till 2,0% (volym / volym) isofluran i syre (1 liter / min).
3. Beredning av möss för kirurgi och transplantation
- Håll den manliga vuxna CD1 möss (25-30 g) under minst 3 dagar innan experimenten i standardförhållanden (22 ± 2 ° C, 65% luftfuktighet och artificiella ljus mellan 8:00 till 8:00).
OBS: Hela proceduren från kirurgisk förberedelse till suturering tar ca 40 min.- För att identifiera djuret, markera svansen genom vattenresistent färgat bläck.
- Använd en electric clipper att klippa rygg håret av musen från halsen, ungefär på T2 nivå, till ländryggen området.
- Sterilisera den preparerade ytan med en jodid lösning och etanol (70% i sterilt vatten).
- Behandla djuret med en sub kutan (SC) injektion av 200 | il gentamycin (1 mg / ml i steril saltlösning).
- Applicera oftalmisk smörjmedel på båda djurs ögon för att förhindra uttorkning och injicera buprenorfin (subkutant, 0,03 mg / kg) för att lindra smärta.
4. Laminektomi
- Placera musen på en bild varmare för att undvika problemet med hypotermi under operationen. Placera djuret med ryggsidan uppåt.
- Gör en vertikalt snitt med en skalpell över regionen av intresse, från T7 till T12.
- Håll huden och ytliga fett pad genom att använda standard pincett (vanligtvis finns i utrymmet mellan 5: e och 6: e bröstkorg ryggprocesser).
- Räkna processen under kärlet som T6sedan flytta till T7.
- Placera en liten betydelse enligt den ventrala sidan av musen för att öka krökningen hos ryggraden. Immobilisera ryggmärgen genom att blockera den med Graefe pincett.
- Skär paravertebrala muskler bilateralt från T7 och T10 vertebrala nivå med hjälp av skalpell tills den dorsala ytan av lamina kontakt med skalpell spets.
- Använd skalpell för att pricka av korsningen från T7 tills T10. Stopp i utrymmet mellan T8 och T9 taggiga utskjutande. Skär vävnaderna mellan T8-T9 och T9-T10 med mikro sax.
- Använd rongeur att ta bort T9 processen. Exponera korsningen genom att försiktigt skrapa bort muskellagret med mikro sax. Fortsätt tills benet är utsatt.
- Använd pincett för att ta bort muskler från lamina och öppna ett litet utrymme mellan kotorna. Försiktigt in mikro saxen i benet, skär lamina på båda sidor och ta bort denna del med pincett.
- Ta lamina med forceps att exponera sladden. Glöm inte att lämna några fria eller ojämna benfragment bakom; ta bort dem med rongeur.
- Använd de små spets pincett för att avlägsna periostet samt eventuella benfragment eller muskler som kan vara nära snittet.
- Ta bort den övre halvan av T9 ryggprocessen och fortsätta till IH Impactor anordningsprotokoll.
5. IH Impactor Device Protocol (Kontusion)
- Placera musen i mitten av stabiliseringsplattformens av IH Impactor enheten.
- Blockera djuret med de två tänder tången samband med stabiliseringen plattform genom två gemensamma positioneringsarmar (vänster arm för bröstkotan, höger arm för halskotan).
- Använd den rostrala armen för att ta tag i sidokanten på den rostrala kotkroppen (T8).
- Manipulera den kaudala armen på samma sätt för att ta tag i T10 kotkroppen.
- Placera stabiliseringsplattform i enheten och sänk spetsen (diameter 0,75mm) så nära sladden som möjligt utan att vidröra den.
- Lyft spetsen tre hela varv innan den inleder påverkan.
- Utför kontusion med provkroppen inställd att leverera en kraft på 60 kdyn vid 100 mm / sek.
6. Suturer och Post-och sjukvård
- Sutur snittet med en 4/0 absorber sutur tråden. Täck den exponerade ryggmärgen på platsen för bort lamina; sutur vävnaden genom ytterpunkterna av snittet med hjälp av en liten nål. Sätt de två maskor omedelbart ovanför och under platsen för ryggmärgs exponering.
- Stäng huden med två eller tre Reflex klipp utan att klämma ut de underliggande musklerna.
- Hydratisera mus efter operationen med 2 ml koksaltlösning subkutant injicerade i nedre ryggen.
- Placera musen tillbaka i en förvärmd bur för att undvika hypotermi under kirurgisk återhämtning. Placera burar på värmedynor.
- Övervaka mössen under den akuta fasen efter skada genom att kontrollerastorlek blåsan, suturen och djuret vikt två gånger om dagen. Kläm försiktigt blåsa (två gånger om dagen i 7 dagar) för att undvika urinvägarna s infektioner (urin kan vara molnigt, blodig eller som innehåller fällningar).
- Behandla möss en gång om dagen med en saltlösning injektion (2 ml under två dagar efter kirurgi SC-injektion) och antibiotika (gentamycin 0,2 ml; sc injektion) under fem dagar efter skada.
- Behandla möss för postoperativ smärtlindring med buprenorfin (0,1 mg / kg, två gånger om dagen) under 3 dagar efter skadan.
7. Tail Vein Injektion av celler
OBS: I det följande steget av förfarandet för insprutning av cellerna i svansvenen demonstreras. Celler kan också administreras med en intraspinal transplantation med hjälp av en stereotaktisk ram 15-16, eller in i cisterna magna 17. Det är viktigt att tänka på att andra celltyper kan transplanteras med denna metod, såsom mesenkymala stromaceller(t.ex. benmärg mesenkymala stamceller, adipos härledda stamceller, fostervattenceller). Vidare kan andra behandlingsalternativ såsom nanopartiklar injiceras via svansvenen efter ryggmärgsskada.
- Använd 70% etanol och PBS för att rengöra nålen före användning. Hantera nålen och sprutan endast med sterila handskar.
- Resuspendera cellerna i provröret och belastning 75 | il celler i en 0,3 ml spruta (29 G nål och 0,33 cc spruta).
- Se till att inga bubblor inuti cellsuspension. Förvara sprutan i horisontellt läge för att undvika cellsedimentering.
- Placera musen under värmelampa för att vidga svansvenerna.
- Ta musen och dra den försiktigt i musen som hindrar att visualisera den laterala svansvenen som en smal blå linje.
- Rengör svansen med en alkoholservett. När venen visualiseras, greppa svansvenen mellan långfingret och tummen på vänster hand.
- Ta nålen till ytan vid en 15 ° vinkel från horisonten och se till att avfasning är upp.
- Injicera 50 ul av celler med en hastighet av 0,33 | il / sek. Efter injektionen, försena indragning av nålen genom 10 sek. Dra tillbaka nålen långsamt och uppmärksamma eventuell utflödet av cellsuspension.
- Rengör sprutan som i steg 7.1 mellan laster.
8. beteendetester och Hind Limb Funktion
- Placera musen i det öppna fältet.
- Utvärdera motorisk funktion och bakbenen återhämtning efter kontusion med den öppna fälttestet enligt Basso musen skalan (BMS) 18.
OBS: Neurologisk funktion måste utvärderas regelbundet, från dag 3 efter skada i 4 veckor 18.
9. Perfusion
- Vid slutet av försöksperioden, söva djuren med en intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (65 mg / kg). Använd tå nypor att evaluate anestesi nivån och gå först efter musen inte svarar på de skadliga stimuli.
- Håll fast hästens i ryggläge på en operation planet.
- Skär igenom utrustningen och bukväggen strax under bröstkorgen. Separera membranet från levern.
- Använd sax för att klippa membranet att exponera pleurahålan.
- Skär sidorna av bröstkorgen tills kragen ben.
- Använd peanger att klämma xiphoid brosk och placera hemostat över huvudet.
- Håll den nedre tredjedelen av hjärta på en tvärgående plan med pincetten. Stick in nålen i vänster kammare.
- Använd en hemostat att klämma hjärtat. Detta säkrar nålen och förhindrar läckage.
- Använd sax för att klippa höger förmak.
- Låt PBS för att pumpa (18 ml / min) genom djuret. Behåll detta tryck under hela buffertinfusionsperioden (3-4 min; motsvarande cirka 70 ml PBS). Fortsätt tills hjärtat är rent.
- Växla kranen för att tillåta fixativ (4% paraformaldehyd i destillerat vatten, 4% PFA) genom pumpen. Låt 4% PFA att pumpa igenom djuret under approximativt 8-10 minuter (300 ml). Gradvis öka trycket för att uppgå till högst 30 ml / min. En härdad levern är den bästa indikationen på en lyckad perfusion.
10. Tissue Insamling och bearbetning, histologi och Iimmunohistochemistry
- Dissekera ryggmärg från T5 till L1. Därefter efter fixera vävnad i 6 ml i 4% PFA (O / N vid 4 ° C).
- Lägg samma vävnad i en lösning med 30% sackaros under 72 h vid 4 ° C för att kryo skydda den och för att förhindra bildning av kristaller under frysning.
- Snabb frysa sladden med torris och förvara den vid -80 ° C.
- Avsnitt medelst en kryostat med 15 um tjocklek och samla sektionerna på objektglas och fortsätta för immuncytokemi.
- Skölj sektioner med 200 l PBS för varje slide (3 gånger; 5 minuter vardera, RT).
- Permeabilize varje objektglas med 200 ul av 10% NGS och 0,2% Triton X-100 i PBS under 1 h vid RT.
- Skölj sektioner med 200 l PBS för varje bild (3 gånger, 5 minuter vardera, RT).
- Blockera icke-specifika ställen med 200 pl blockeringslösning för sliden (5% NGS, 0,1% Triton X-100 i PBS) under 30 min (RT).
- Inkubera varje objektglas med 200 pl av primära antikroppar O / N vid 4 ° C (utspädd antikropp i 5% NGS, 0,1% Triton X-100 i PBS).
- Tvätta sektioner med 200 l PBS för varje bild (3 gånger, 5 minuter vardera, RT).
- Inkubera med lämpliga sekundära antikroppar för 2 h vid RT.
- Tvätta sektioner med 200 l PBS för varje bild (3 gånger, 5 minuter vardera, RT).
- Fläcken kärnor med 200 pl av 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 | ag / ml slutkoncentration, 10 min vid RT).
- Montera med hjälp av FluorSave Reagens och analysera med konfokalmikroskopi.
OBS: Ikontrollbestäm, primära antikroppar måste utelämnas och ersätts med motsvarande koncentrationer av orelaterad IgG av samma underklass. Mikrotubuli-associerat protein 2 primär antikropp användes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det totala antalet av transplanterade celler är en x 10 6 celler och delades in i tre på varandra följande injektioner i svansvenen. Vi administrerade 3.3 x 10 5 celler i 50 pl fosfatbuffertlösning (PBS). Den första injektionen utfördes inom 30 min efter skada, den andra 6 h senare och de sista 18 h efter lesionen. Valet av en tidsfrist på 18 timmar efter SCI för att administrera PM-NPCs bestämdes genom den optimala permeabilitet blod-hjärnbarriären vid denna tid 14. För att utvärdera effekten av stamceller injektion det skulle vara bra att ha positiva kontroll laminektomier djur (n = 14) och PBS injicerade djur som en negativ kontroll (n = 14).
PM-NPCs Förbättra Återvinning av Hind Limb Funktion, migrera till skadestället och differentiera i MAP-2 positiva celler
T9 kontusion orsakade övergående förlust av bakbensfunktion följt av en progressiv gradual återhämtning (Figur 1). Inom 2-3 veckor, PBS-behandlade skadade mössen förbättrades och bakbenen funktion nådde 3 poäng av BMS (motsvarande plantar placering av tassen med eller utan viktstöd eller tillfällig, frekvent, eller konsekvent rygg stepping, men inte plantar kliva 18) . Istället inom samma observationsperiod, skadade möss behandlade med PM-NPC visade en högre återhämtning, nådde 4,5 poäng av BMS (motsvarande frekvent eller konsekvent plantar stepping utan samordning, eller ofta eller konsekvent plantar stega med viss samordning). Beteende förbättringen var särskilt tydlig i perioden mellan dag 7 och dag 14 efter SCI. Inga tecken på allodyni liknande forelimb hyper sensibilitet 19 registrerades som helst i någon försöksgruppen under observationsperioden på 30 dagar.
Mest engrafted PM-NPC, märkt med PKH26 (figur 2), ackumuleras vid kanterna avlesion bildande kluster (Figur 3) från de första dagarna av sin förvaltning. Då de transplanterade cellerna migrerat längs lesion kanterna och på ett mer diffust sätt där de differentierade, successivt antar den asymmetriska cellulära konforma av nervceller. Vid 30 dagar efter skada och transplantation, ökade cellkroppen av PM-NPCS i storlek och i de flesta celler dendritiska liknande processer var uppenbara och fullt immunostained av specifika antikroppar till MAP-2 (Figur 4). Förverkligandet av morfologiska komplexitet och positivitet till MAP2 av transplanterade PM-NPCs sannolikt inte beror på fusion med överlevande värd ryggmärgsneuroner, vilket är tydligt i deras tydligt differentierade morfologi och frånvaron av två kärnor i en enskild märkt cell.
Figur 1. PM-NPCs förbättrar funktionell åter-Ery i skadade djur. Den öppna fält locomotion var det test som används för att fastställa motorik återhämtning 18. Djuren testades dagen före kontusion och scored nio punkter i BMS skala. Den första dagen efter skada i de skadade djuren minskade BMS poäng till noll. Återhämtningen av bakbenet funktion skadad möss visade en anmärkningsvärd och långvarig förbättring när djuren behandlades med PM-NPCs. Analysen utfördes i dubbelblinda, och varje grupp bestod av 14 djur. Värden representerar genomsnitt ± SEM. Vi bestämde de statistiska skillnaderna med hjälp av ANOVA-test följt av Tukeys efter provet. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.
Figur 2. PKH26 märkning av PM-NPCS. Efter förfarande märkning med PKH26, PMNPCS är visu liserade med sökarbilden mikroskopet Evos fl och mikrofotografi togs med samma instrument (skala bar = 50 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Lokalisering av PM-NPC i lesionsstället. PKH26-märkta PM-NPC (röd) är närvarande under hela kanterna på skadestället vid 30 dagar efter deras iv-injektion. Bilden är representativt för 1 mus, men liknande bilder erhölls i minst 5 djur (skala bar = 50 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
belastning / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Figur 4. MAP2 uttryck i transplanterade PM-NPC. Mest PKH26-märkta PM-NPC (röd) förvärvade en neuronal-liknande form med dendritiska liknande processer och hade differentierat MAP-2-positiva celler (gröna). Kärnor färgas i blått (DAPI). Bilden är representativt för 1 mus, men liknande bilder erhölls i minst 5 djur (skala bar = 25 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna uppsats beskrev vi en metod för att erhålla en reproducerbar modell av traumatisk ryggmärgsskada med hjälp av en oändlig Horizon Impactor vid en kraft på 70 Kdyne (svår). Med hjälp av en större kraft paradigm (80 Kdyne), kan vi orsaka en allvarligare skada som tyvärr är förknippad med högre möss dödlighet. För att undvika detta problem, väljer vi ofta en måttlig kraft paradigm (70 Kdyne) som är associerad till en repeterbar lesion med en gradvis återhämtning av funktion och lägre dödlighet. För att producera en sådan stabil skada är det mycket viktigt att ägna särskild uppmärksamhet åt den korrekta fixering av djuret på provkroppen plattform; särskilt ryggmärgen måste vara centrerad på provkroppen spetsen, och de två grenarna av provkroppen skall vara parallella med varandra. Dessutom måste uppmärksamhet tas i att blockera djuret med provkroppen pincett, då kotorna kan krossas och sladden kan skadas av tips av pincetten. Positioneringen av animal efter laminektomi är kritisk, och djuret hantering under detta förfarande är också mycket viktigt. Särskild uppmärksamhet måste också ägnas laminektomistället förfarandet, som alltid måste utföras på samma plats och för samma förlängning. När dessa procedurer utförs under laminektomi, är en annan metodfrågan att övervaka minskningen av risken att skada sladden vid användning mikro-sax, rongeur eller pincett för att klippa ben och befria sladden genom borttagande av lamina, för att eliminera återstående sido utbuktningar och fragment ben, och att ta bort benhinnan. Användningen av mikro sax och rongeur med tips som pekar uppåt kommer att minska risken för att stöta nämnda problemen.
En viktig begränsning med denna metod är den höga sannolikheten att djuren kan utveckla interna och externa allvarliga urinvägsinfektioner under efterskadeperioden. Den externa infektionen beror på oförmåga skadade mössen till move med bakbensviktavlastning. Däremot kan den interna urinvägsinfektion orsakas av oförmåga skadade mössen att urinera självständigt. För att undvika dessa problem är det absolut nödvändigt att injicera djuren med den angivna antibiotika och för att kontrollera storleken på blåsan två gånger om dagen under de förfaranden djurvårds av den första veckan. Vätskestatus och vikten måste kontrolleras noggrant under de första tre veckorna efter lesionering.
Tillämpa de beskrivna förfarandena vi kunde få reproducerbara underskott bakbens funktion som utvärderades genom en särskild beteendetestet utvecklats av Basso och kollegor (BMS) 18. Omedelbart efter skadan bakbensfunktionsförlust är fullständig, vilket följs av en gradvis återhämtning som är viktigast under de första 2-3 veckorna. Den beteendemässiga återhämtning nått en högre nivå när skadade möss behandlades med vuxen PM-NPC (Figur 1 (Figur 3). Vi uppskattar att det totala antalet vital ympade PM-NPCs är större än de ympade ekonomiska och sociala råden och vuxna NSCs som tidigare rapporterats av vår forskargrupp 20-21. Vid fyra veckor efter lesionering och transplantation, de flesta PM-NPC har större kroppar och besitter förlängt dendritiska liknande processer som är helt immunostained av de specifika antikropparna till MAP-2 (fig 4).
Den stora fördelen med denna modell av traumatisk ryggmärgsskada är standardiseringen av skadan. En reproducerbar tidsrelaterad kurvan för bakbens återhämtning av funktion uppnås också. Sådan reproducerbarhet gör det möjligt att definiera proof-of-principle studier för undersökta behandlingar inklusive transplantation av celler för regenerativ medicin studiear med ett begränsat antal fall. Dessutom kan flera aspekter av patofysiologin för ryggmärgsskada analyseras i större detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiskt intresse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W.
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
