Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

Abstract

סרוטיפ אדנווירוס 5 (Ad5) השתנה באופן נרחב בשיטות מסורתיות transgene לפיתוח החיסון. Efficacies המופחת של וקטורי Ad5 שונה באופן מסורתי אלה בניסויים קליניים יכול להיות מתואם בעיקר עם חסינות Ad5 קיימים מראש (PEI) בקרב רוב האוכלוסייה. כדי לקדם את פיתוח חיסון-וקטורי Ad5 על ידי פתרון הדאגה של Ad5 PEI, אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות החדשנית כבר מועסק. על ידי הכשרון של אסטרטגיה זו, Ad5-וקטורים שנבנינו מעבורת hexon ראשונה פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S ידי subcloning אזור hypervariable (HVR) 1 של hexon לפלסמיד הסעות נבנה בעבר HVR5-6 / pH5S, שהיה לו תג 6 שולב HVR5. בר זה HVR1 DNA המכיל HIV epitope ELDKWAS היה מסונתז. HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S היה אז לינארית ושיתוף הפך עם pAd5 פלסמיד עמוד השדרה לינארית / ΔH5 (GL),לרקומבינציה ההומולוגית. פלסמיד recombined זה pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 היה transfected לתאים לייצר הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. וקטור זו קיבל תוקף יש כושר איכותי שצוין על ידי כייל פיזי (סמנכ"ל / מיליליטר) נגיפי, כייל זיהומיות (IP / מיליליטר) וסמנכ"ל יחס / IP מתאים. שני epitope HIV והתג 6 שלו היו בקפסיד Ad5 משטח חשוף, ושמר על antigenicity epitope הספציפי משלהם. Assay נטרול הצביע על היכולת של וקטור דו ערכי זה לעקוף נטרול על ידי סרה Ad5 חיובית במבחנה. חיסון עכברים הוכיח את הדור של ספציפי חסינות הלחות החזקה לאפיטופ HIV ו -6. מחקר ההוכחה של עיקרון זה הציע כי הפרוטוקול הקשורים לאסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכול להיות מנוצל יתכן עבור הדור של חיסוני וקטורים-Ad5 ידי שינוי חלבוני קפסיד שונים. פרוטוקול זה יכול אפילו להיות further שונה עבור הדור של חיסונים-וקטורי אדנווירוס נדיר-סרוטיפ.

Introduction

אדנווירוס אדם (מודעות) הוא וירוס עם nucleocapsid icosahedral מכיל הגנום DNA גדילים כפול בגודל בינוני, שאינו-עטף. מודעות שייכת למשפחת adenoviridae, עם סיווג לשבע קבוצות (עד G). כל קבוצה מכילה וירוס של סרוטיפים שונים. מזה, אדנווירוס סרוטיפ 5 (Ad5) מהקבוצה C כבר בהרחבה הנחקרת ביותר ומיושמים באופן נרחב ביותר לגישות וקטורים כמו ריפוי גנטי וחיסונים.

אסטרטגית transgene המסורתית פותחה ומיושמת לשינויים Ad5, המתאפיין בתזוזה של גנים המוקדמים הווירוס עם גן-של-עניין, והביטוי הממוקד של הגן-של-עניין במארח. דוגמאות לכך הן הבנייה של pENV9 / Ad5hrΔE3 ידי החלפת גנים מוקדמים 3 (E3) עם גן rev של קופי וירוס כשל חיסוני 1, בניית AdCMVGag ידי החלפת גנים מוקדמים 1 (E1) עם גן איסור הפרסום של כשל חיסוני אנושיוירוס (HIV) 2, והבנייה של Z לאק מודעות על ידי החלפת E1 עם גן Z אק 3. היישום הרחב של אסטרטגית transgene המסורתית על Ad5 תלוי בגוף הבא: מגוון הרחב של מארחים לAd5, ההנדסה הגנטית אפשרית בנגיף והתפשטות וירוס, האירוח הגדול של הכנס גן זר והבטיחות של Ad5 4,5. עם זאת, efficacies המופחת של טיפולים קליניים וקטורים-Ad5 על ידי שימוש באסטרטגיה זו היה צוואר בקבוק עיקרי, אשר מופה להיות קשורות בעיקר עם Ad5 PEI, מאז Ad5 היא כל כך נפוץ בקרב רוב הילדים ומבוגרים 4,6.

כדי להתגבר על צוואר הבקבוק העיקרי של Ad5, המטרה העיקרית היא לפתח אסטרטגיה חלופית עקיפת Ad5 PEI. חסינות מולדת 7, חסינות אדפטיבית כגון נוגדנים מנטרלים תגובות תא (nabs) 8-10 וCD8 + T 10 נגד Ad5 הוכחו שיתוףntribute לAd5 PEI, עם Ad5 nabs מופיע לשחק את התפקיד הדומיננטי בתרומות לAd5 PEI 10,11. יתר על כן, Ad5 nabs epitopes היעד ממוקמת בחלבוני קפסיד, כולל hexon העיקרי החלבון, סיבים ובסיס פנטון. מזה, hexon הוא היעד העיקרי של Ad5 nabs 8,11-13. בהתבסס על ממצאים אלה, אסטרטגית Antigen capsid על-התאגדות חדשנית כבר הציגה. אסטרטגית רומן זה מדגישה את ההחלפה או שילוב של חלבונים של ריבית על חלבוני קפסיד Ad5, שעוברים או מסכות epitopes Ad5 נטרול, שמובילה להכרה ירד ב nabs וממשלי וקטור Ad5 יעילים. ראוי לציין כי אסטרטגיה זו היא תחרותית כי זה גם יכול לעזור מארחים לעורר חסינות הלחות חזקה וחסינות תאית חזקה ישירות על ידי הצגת אנטיגנים של עניין למערכת החיסונית 4,14,15. בהתבסס על אסטרטגיה זו, השיבוט המולקולרי והצלת וקטור נגיפי מודעות רקומביננטי ניתן לחלק מבנילארבעה שלבים עיקריים: (א) הכנת בר הגן-של-עניין מתגובה או שרשרת פולימרז (PCR) או סינתזה; (ב) קשירה של בר הגן לפלסמיד הסעות המכיל את קטע הגן-של-עניין וזרועות הומולוגיות לשדרת אדנווירוס; רקומבינציה ההומולוגית על ידי (ג) פלסמיד ההסעות המכיל בר הגן-של-עניין עם פלסמיד עמוד השדרה לינארית pAd5 / ΔH5 (GL) 16 הפיכת שותף; (ד) transfection של פלסמיד adenoviral רקומביננטי לינארית כדי להציל את וקטור מודעות רקומביננטי משולב עם אנטיגנים של עניין.

הקבוצה ועוד כמה שלנו הרחיבו את האסטרטגיה זו חלופת מודעות התאגדות לפיתוח חיסון וקטורי מודעות נגד פתוגנים זיהומיות שונים. דיווחנו הדור של וקטור רקומביננטי מודעת מודעה-HVR1-LGS-6 -V3 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 מתויג V3 לאזור HVR1 של hexon Ad5 (hexon5). וקטור שנוצר זה מופעל על strתגובת אונג הלחות חיסון ספציפית לאפיטופ V3 4. אנחנו גם דיווחו על ההתפתחות של Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 על ידי שילוב אזור HIV-1 קרום ectodomain הפרוקסימלי (MPER) לאזור HVR2 של hexon5 2. בנוסף, קבוצתו של ד"ר ג 'והשתמשה ביתרונות של אסטרטגית התאגדות מודעות זו לפתח מודעות סרוטיפ 3 (Ad3) חיסוני וקטורים, כלומר., הדור של R1SP70A3 וקטור הנגיפי על ידי שילוב SP70 epitope נטרול של Enterovirus 71 לHVR1 של Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 נוצר nabs חזק וייצור IFN-γ הספציפי לSP70 epitope, שיוביל לשיעור הגבוה של הגנה מפני Enterovirus 71 אתגר 15.

לצורך ההתייחסות הטכנית, המחקר שלנו ניצל את אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות האיכותית להתמקד בדור של וקטור Ad5 דו ערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 לHVR1דה תגו לHVR5 של hexon5. הווקטור הנגיפי שנוצר היה גם הערכת מערכת חיסון. אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכולה להיות מנוצלת לפיתוח גישות חיסון וקטורים-Ad5 נגד מחלות זיהומיות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם בבעלי חיים מוסדי שימוש וטיפול הוועדה אישרה את השימוש בעכברים כמתואר במסמך זה תחת מספר הפרוטוקול שאושר על 101,109,272.

1. גנטי בנייה השתנה פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 עם capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen

  1. בנייה של פלסמיד הסעות HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S
    1. להזמין פלסמיד המכיל את רצף ה- DNA מסונתז HVR1-קוואס בין AgeI אתרי אנזים הגבלה לAccI של גן hexon5.
    2. לעכל 6 מיקרוגרם של הבר מסונתז (HVR1-קוואס) עם AgeI האנזימים (6 יחידות) וAccI (6 יחידות) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לפתור את הבר מתעכל ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי, ולטהר את הקטע עם ערכת חילוץ ג'ל DNA על פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. בהתבסס על היחס טוחנת של הכנס לוקטור ב -3: 1, להשתמש באנזים T4 DNA ואנזים בuffer לקשור 12 ng של הבר (HVR1-קוואס) לשל פלסמיד הסעות נבנה בעבר 100 ng HVR5-6/17 בpH5S 10 μl נפח ב RT עבור שעה 2, באמצעות האתרים של AgeI וAccI.
    4. להפוך 1 μl מתוך 10 μl של מוצר קשירה לתוך 50 μl של תאי DH5α electrocompetent בelectroporator (ב 1800 V). להוסיף 950 μl של מדיום SOC לתאי DH5α הפכו דגירה את התערובת למשך שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, עם 300 סל"ד. מורחים 100-200 μl של התערובת 1 מיליליטר על אגר לוריא-Bertani (LB) המכיל kanamycin דגירה O / N על 37 מעלות צלזיוס.
      1. למסך ~ 10 מושבות על ידי PCR מיקוד הבר HVR1-קוואס, לערבב פריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT), לאחור תחל (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) ומושבת DH5α יחידה לפתרון תערובת אמן PCR (על פי הפרוטוקול של היצרן). הפעל דגימות על thermocycler על ידי פנייה למדריך שסופק עם פתרון תערובת אמן PCR.
      2. השתמש בפריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT) רצף הבר HVR1-קוואס בשיבוטים הוקרנו בסעיף 1.1.4.1.
  2. בנייה של פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. תקציר 6 מיקרוגרם של HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S עם האנזימים EcoRI (6 יחידות) וPmeI (6 יחידות) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, ולטהר את הבר המכיל נשק רקומבינציה הומולוגי וגן hexon5 שונה הכפול, כאמור בשלב 1.1.2. Linearize פלסמיד עמוד השדרה pAd5 / ΔH5 (GL) 16 עם שואי.
    2. שיתוף להפוך של בר היעד מפלסמיד ההסעות 100 ng ושל עמוד השדרה pAd5 / ΔH5 לינארית (GL) 100 ng לתוך 50 μl של תאי BJ5183 electrocompetent לרקומבינציה ההומולוגית בelectroporator (ב 1800 V). להוסיף 950 μl של מדיום SOC לתאים הפכו דגירה את התערובת למשך שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד. מורחים 100 - תערובת 1 מיליליטר 200 μlעל אגר LB המכיל kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) עבור O / דגירה N על 37 מעלות צלזיוס.
      1. פיק ~ 10 מושבות זעירות לתוך 3 מיליליטר LB הנוזלי המכיל kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) עבור O / דגירה N שבייקר (250 סל"ד, 37 ° C). לחלץ פלסמידים מהתרבות. השתמש ניתוח PCR מסך 10 מושבות על ידי מיקוד הבר HVR1-קוואס, כפי שמודגם בצעד 1.1.4.1.
      2. להקרין את אותו מושבות על ידי ניתוח PCR מיקוד בר PIX של הגנום עמוד השדרה, לערבב פריימר קדימה (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), לאחור תחל (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) וBJ5183 מושבה אחת לפתרון תערובת אמן PCR (על פי הפרוטוקול של היצרן). הפעל דגימות על thermocycler על ידי פנייה למדריך שסופק עם פתרון תערובת אמן PCR.
      3. לייעד את המושבות כפולות החיוביות PCR כpAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.
    3. להפוך של פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 100 ng בלDH5α תאים כפי שמודגם בשלב 1.1.4.
      1. השתמש ניתוח PCR מסך ~ 10 מושבות על ידי מיקוד הבר HVR1-קוואס, כפי שמודגם בצעד 1.1.4.1.
      2. השתמש ניתוח PCR להקרין את אותו מושבות על ידי מיקוד בר PIX של הגנום עמוד השדרה, כפי שמודגם בשלב 1.2.2.2.
      3. השתמש בפריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT) רצף הבר HVR1-קוואס בpAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.

2. הכנת השתנה Ad5 ויראלי וקטור Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6

  1. מהווה את המדיום המלא על ידי הוספת FBS (סופיים 10%), חומצות אמינו 100X שאינו חיוניות (סופי 0.1 מ"מ), L-גלוטמין 200 מ"מ (סופי 2 מ"מ) ופניצילין / פתרון סטרפטומיצין (1% סופיים) לDMEM עם גלוקוז גבוה . שמור על תאים אנושיים כליה עוברית (HEK293) במדיום מלא בתרבות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 תחת 85% תנאי humidified).
  2. הצלה של נגיפי vector Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. זרע 3.0 x 10 6 תאי HEK293 באחד בקבוק T-25 המכיל 5 מיליליטר של מדיום מלא ותרבות O / N להשיג monolayer עם מפגש 80%.
    2. Linearize 15 מיקרוגרם של pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 בנפח 100 μl עם אנזים הגבלת פאצ'י (15 יחידות) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
      1. לחלץ ינארית pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי צנטריפוגה התגובה פעמיים (10,000 XG דקות 1) עם נפח שווה של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (יחס של 25: 24: 1) במנדף , ועל ידי צנטריפוגה רציפה (10,000 XG במשך 10 דקות) עם פתרון מעורב (300 μl של 100% אתנול ו -10 μl של נתרן אצטט) ו -700 μl של 70% אתנול. בטל supernatant בכל שלב צנטריפוגה.
    3. Resuspend פלסמיד המטוהר ב~ 40 μl של מים מזוקקים או חיץ טריס-EDTA (TE). לכמת את ה- DNA פלסמיד על ידי מדידת דה האופטיתnsity (OD) ב 260 ננומטר.
    4. Transfect 3 מיקרוגרם של פלסמיד לינארית עם מגיב transfection liposomal מסחרי בבקבוק T-25, על פי הוראות היצרן. לשנות את מדיום transfection עם מדיום מלא ב6 שעות לאחר transfection ודגירה לאחר מכן בחממת התרבות. שמור על תאי transfected על ידי החלפה בינונית מלא כל שעות עד שלושה ימים, עד שצורת לוחות נגיפיים בודדת.
    5. כאשר לוחות לפתח להשפעה מלאה cytopathic (CPE), לגרד את התאים הנותרים את הבקבוק במנדף סטרילי, ותא קציר lysate ידי צנטריפוגה בינונית XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשעות את התא גלולה ב~ 1 מיליליטר של מדיום המכיל 2% FBS, ולשבור תאים על ידי ארבע פעמים הקפאה-הפשרה. לאסוף את supernatant המכיל וירוס חולץ לאחר צנטריפוגה lysate על 10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. התפשטות בקנה מידה גדולה של הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. הפץ הוירוס דואר בבקבוק T-75 המכילים תאי HEK293 בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/3 לlysate מלא מהבקבוק T-25. לאפשר CPE מלא לפתח בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5.
    2. הפץ את הנגיף ב02:59 T-175 צלוחיות בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/2 לlysate מלא מהבקבוק T-75, תלוי בתנאי התפשטות וירוס. לאפשר CPE מלא לפתח בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5.
    3. הפץ את הנגיף בעשרות אחד או יותר T-175 צלוחיות בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/2 לlysate מלא מהבקבוק הקודם T-175 (ים). לקבוע את כמות השימוש בבקבוק המבוסס על תנאי התפשטות נגיף ואת כמות הנגיף בצורך. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5 כאשר CPE המלא מתרחש בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות.
  4. מגעים תחנותication של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי צזיום כלוריד
    1. הכן שתי צפיפויות של פתרונות CsCl ב5 מ"מ HEPES: 1.33 גר '/ מיליליטר ו1.45 גר' / מיליליטר, ואילו הימנעות ממגע עם CsCl.
    2. 4 מיליליטר עומס של CsCl (1.33 גר '/ מיליליטר) בצינור ultracentrifuge סטרילי, ובעדינות לטעון 4 מיליליטר של CsCl (1.45 גר' / מיליליטר) נגד חלק תחתון של הצינור. טען 4 מיליליטר של supernatant lysate לאט על גבי מילויים בשכונה סטרילי.
    3. צנטריפוגה הצינור ב110,000 XG במשך 3 שעות ב 4 ° C כדי להפריד את להקת הווירוס הבוגרת / נמוכה מהלהקה הווירוס הפגומה / גבוהה יותר. לאסוף את הרצועה התחתונה באמצעות מזרק 3 מיליליטר חמוש במחט G 33 ולדלל את הלהקה עם 5 מ"מ HEPES ל4 מיליליטר נפח בשכונה סטרילי.
    4. לטעון צינור אחר עם שתי צפיפויות של פתרונות CsCl והלהקה המדולל של וירוס כמתואר בשלב 2.4.2. צנטריפוגה הצינור ב110,000 O XG / N ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את הלהקה הנגיפית כמתואר בשלב 2.4.3.
    5. להזריק את פתרון וירוס שנאסף בdialysהוא קלטת על ידי מזרק 3 מיליליטר חמוש במחט G 33 בשכונה סטרילי.
    6. מניחים את הקלטת ב700 מיליליטר של חיץ הדיאליזה 1x (מתכון L 1: של 10x PBS 100 מיליליטר, של גליצרול 100% 100 מיליליטר ו -800 מיליליטר של מים מזוקקים; לסנן את החיץ דרך פילטר 0.22 מיקרומטר) ולהחליף את חיץ הדיאליזה כל 3 שעות במשך 4 פעמים. לשאוב את פתרון וירוס דיאליזה באמצעות מזרק המחטניים.

3. אישור של וקטור ויראלי הציל

  1. Titrations וקטור ויראלי
    1. לכייל הנגיף הפיזי, לדלל שני וירוס וחיץ דיאליזה (שליטת רקע) ב 1: 10 ו -1: 20 במאגר תמוגה הווירוס (10% SDS בטריס-EDTA) בצינורות קטנים, ודגירה כל הצינורות על 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    2. הפעל biophotometer ולהגדיר את המצב של הספיגה ב ננומטר OD 260. השתמש בחיץ המדולל הדיאליזה (1: 10) כדי לאזן את אות רקע על ידי לחיצה בתחתית "ריקה". סוג "10 + 90" בSCR biophotometereen, ולקרוא את האות של הנגיף בדילול מלא (1: 10).
    3. קרא את האות של הנגיף בדילול מלא (1: 20) על ידי ביצוע השיטה בשלב 3.1.2, אבל במקום להקליד "5 + 95" במסך biophotometer. להכפיל שני מספרי קריאת נתוני וירוס על ידי 1.1x10 12 ולחשב את כייל הממוצע עם יחידה כסמנכ"ל / מיליליטר, המבוסס על שני titers הבודד משני דילולים.
    4. לכייל הנגיף המדבק (IP / מיליליטר), להשתמש בTCID הסטטיסטי KARBER 50 השיטה 14 על מנת לקבוע את עומק הזיהום בHEK293 תאים שבלאחר זיהום 10 ימים (dpi)
  2. הערכה של תצוגת חשיפת אנטיגני על וקטור ויראלי
    1. מעיל וקטור ויראלי בצלחת ELISA ולהמשיך עם שאר צעדים בשיטת ELISA סטנדרטי 14. השתמש נוגדן אנושי אנטי-gp41 (2F5) חד שבטי (מב) ואנטי-מב תג העכבר לצורך זיהוי של אנטיגנים המתאימים שולבו 14.
    2. לפתור את וקטור ויראלי בdenatuאלקטרופורזה האדומה ג'ל החלבון (SDS-עמוד) ולהמשיך עם שאר צעדים בשיטה מערבי כתם סטנדרטי 14. השתמש נוגדן אנושי אנטי-gp41 (2F5) חד שבטי (מב) ואנטי-מב תג העכבר לצורך זיהוי של אנטיגנים המתאימים שולבו 14.
  3. בהערכת מבחנה של הווקטור על היכולת לעקוף סרה Ad5-positve
    1. לשמור על תאי הלה במדיום מלא בחממת התרבות (37 CO מעלות צלזיוס, 5% 2 תחת 85% תנאי humidified). מהווה את המדיום המלא על ידי הוספת FBS (סופיים 10%), 200 מ"מ L- גלוטמין (סופי 2 מ"מ) ופתרון פניצילין / סטרפטומיצין (1% סופיים) לנשר מינימום הכרחי בינוני (Meme).
    2. תאי הלה זרע ב6-גם צלחות ב1x10 6 תאים / טוב, ודגירת הצלחות בחממת התרבות (37 CO מעלות צלזיוס, 5% תנאי humidified 2 תחת 85%) עבור 2 שעות. דגירה סרה Ad5-חיובית (0.1 μl או 0 μl) עם 5 IP / תא של וקטור נגיפי (Ad5 או Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6) בחממת התרבות עבור שעה 1 לפני הוספת התערובות על 6 צלחות המכילות גם תאים.
    3. בגיל 24 שעות שלאחר זיהום (HPI), לשטוף תאים פעם עם PBS ותאי lyse ב 0.5 מיליליטר של חיץ תמוגה. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant. מערבבים 20 μl של supernatant עם מצע של לוציפראז לקריאת אות בלוציפראז 100 μl, מאז וירוסים מכילים את הגן בלוציפראז.

4. חיסוניות הערכה של וקטור ויראלי הציל

  1. הכן שתי קבוצות חיסון: Ad5 וAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.
    1. הזרק עכברים (n = 8 / קבוצה) לשריר עם וירוסים ב1x10 10 סמנכ"ל / עכבר, במשטר הומולוגי "ראש-דחיפה" חיסון, עם מרווח של 2 שבועות.
    2. ב 2 שבועות לפרסם כל זריקה, לדמם עכברים ללא הרדמה על ידי הלחי דימום עם אזמלי בעלי חיים (אורך קצה 5 מ"מ) ללאסוף דם בצינורות 1.5 מיליליטר.
  2. מערבבים את הדם בצינורות על ידי היפוך למעלה ולמטה, ודגירת הדם על RT למשך 30 דקות. ספין הצינורות ב 10,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וסר העברה (שכבה עליונה) לצינורות 1.5 מיליליטר חדשים.
    1. ספין הצינורות החדשים ב10,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וסר להעברה מסומנת חדש 1.5 מיליליטר צינורות לאחסון ב -80 ° C.
  3. הערכה של חסינות הלחות אנטיגן הספציפי על ידי ELISA מבוסס סרה
    1. לדלל פפטיד (מניות ב1 מ"מ) ופפטיד HIV-1 (מניות ב1 מ"מ) בנפרד ב 100.
    2. מאגר מ"מ קרבונט (pH 9.5) כדי להשיג את ריכוז ציפוי פפטיד ב10 מיקרומטר. מעיל צלחות ELISA עם פפטידים מדוללים בנפרד על ידי הוספה בכל טוב 100 μl ודוגרי הצלחות O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. לשטוף את הצלחות עם PBST לארבע פעמים ב 200 μl / טוב ולחסום עבור שעה 1 בBSA 5% בPBST. החל סרה עכברים לצלחות בשעה 1: 100 דילול בbuf החסימהFER, 100 μl / טוב. דגירה הדגירה השעה 2 ב RT.
    4. לשטוף את הצלחות עם PBST לארבע פעמים. לחסום את הצלחות על ידי דוגרים על RT למשך 30 דקות במאגר החסימה ב 100 μl / טוב.
    5. החל עז אנטי עכבר IgG-HRP (1: 5000 במאגר החסימה) ב 100 μl / טוב לשתי הצלחות מצופות פפטיד ופפטיד HIV-1 בנפרד. דגירה עבור שעה 2 ב RT. לשטוף את הצלחות עם PBST.
    6. קראו את הצלחות בננומטר OD450 לאחר דוגרים עם מצע HRP למשך 30 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות (איור 1 א) נוצלה ליצירה דו הערכי הווקטור הנגיפי Ad5 Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. ראשית, הסעות פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S נבנה על ידי subcloning בר HVR1-קוואס לפלסמיד ההסעות נבנו הקודם HVR5-6 / pH5S 17. שנית, pAd5 פלסמיד / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 14 נבנה על ידי רקומבינציה הומולוגית בין הבר של "EcoRI-HVR1-קוואס-HVR5-His6-PmeI" וpAd5 / ΔH5 לינארית-שואי (GL ) 16 (איור 1). Transfection של פאצ'י מתעכל pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 בבקבוק להוביל T-25 להצלה של הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 14. הווקטור הנגיפי הציל אז מופץ בקנה מידה גדולה ומטוהר על ידי שני מחזורים של ultracentrifuge שיפוע CsCl.

במטרה ללהוכיח את הכדאיות / הכושר של הווקטור הנגיפי הציל Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6, כייל הפיזי נקבע על 1.3 x 10 סמנכ"ל 11 / מיליליטר ידי מדידת העותקים הפיזיים של הגנום נגיפי, וכייל זיהומיות היו נקבע על 1.4 x 10 9 IP / מיליליטר ידי titrating החלקיקים הנגיפיים מדבקים בפועל. יחס סמנכ"ל / IP חושבו לאחר מכן 92 14. בדרך כלל, מודעות עם סמנכ"ל יחס / IP להלן 1,000 מצביעות כושר איכותי של וירוס זה. כדי להדגים אם וירוס הציל זה מציג אנטיגן HIV אנטיגני והתג שלו בהתאמה על פני השטח של hexon5 החלבון העיקרי קפסיד הנגיפי, ELISA נערך עם 2F5 מב האנושי ואנטי-תג עכבר מב, בהתאמה. תוצאות הצביעו על כך ששניהם 2F5 מב האנושי (איור 2 א) 14 ואנטי-תג מב (איור 2) 14 העכבר הראו מחייבים Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6, ואילו לא היו מחייב את contro השליליתוקטור l Ad5. ניתוח מערבי כתם שימש כדי לאשר את הנתונים בELISA, כשתי 2F5 מב האנושי (איור 2 ג) 14 ואנטי-תג עכבר מב (איור 2 ד) 14 אותר להקות ספציפיות סביב 117 kDa רק בווירוס Ad5 / H5- HVR1-קוואס-HVR5-6, אשר תואם את גודל חלבון hexon5 של. על מנת להעריך את הפוטנציאל של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 בעקיפת נטרול על ידי סרה Ad5-חיובית, ניתוח assay הנטרול בוצע כאמור בסעיף 3.3 הפרוטוקול. התוצאות הראו כי היחידה זורח ביחס אות (RLU) מהווקטור הנגיפי Ad5 טופל עם 0 μl של Ad5-positve סרה היא 12 פעמים גבוהות יותר מזה מאותו הווקטור מטופלים עם 0.1 μl של Ad5-positve סרה (ערך P <0.001 ). זה הציע הנטרול של הווקטור Ad5 ידי סרה Ad5-positvive. לעומת זאת, היה הבדל קטן מהווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6מטופלים עם 0 μl 0.1 μl של סרה Ad5-positve (איור 3). מאז hexon הוא היעד העיקרי של מודעות nabs, וhexon ספציפי epitopes נטרול מתגוררת בכל HVRs של hexon 12,18, הנתונים הראו לעיל, כי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 נמלטו נטרול על ידי סרה Ad5-positve במבחנה והציע את הפוטנציאל של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על עקיפת Ad5 PEI במארח.

לחקור אם הווקטור הנגיפי Ad5 דו הערכי שונה עם אסטרטגית capsid על-התאגדות Antigen יכול לעורר חסינות הלחות חזקה ספציפית לאנטיגנים של ריבית המשולב, המשטר "ראש-הדחיפה" החיסון יושם לחסן עכברים עם הווקטור נגיפי שליטת Ad5 ו הווקטור דו הערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. ELISA מבוסס סרה מצופה פפטיד HIV-1 הראה כי סרו מקבוצת החיסון של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 היה משמעותיתלא מחייב לפפטיד HIV-1 בדילולים בין 40 ל 640, בהשוואה לסרה מקבוצת הביקורת (ערך P <0.001) (איור 4 א) 14. סרה מבוססת ELISA מצופה פפטיד הראה שסרו מקבוצת החיסון של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 היו משמעותי מחייב לפפטיד בהשוואה לסרה מקבוצת הביקורת, כערך p סטטיסטי < 0.001 בדילולים סרה של 40 ו -80, ערך p <0.01 בדילול ערך p 160 ו< 0.05 בדילול 320 (איור 4) 14. התוצאות לעיל הצביעו על הדור של תגובה חיסונית הלחות נגד אנטיגנים המאוגדת בווקטור הנגיפי דו הערכי.

איור 1
איור 1. איור סכמטי של הבנייה הגנטית של פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 עם אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. () אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות מאופיינת ישירות להציג אנטיגן של ריבית על חלבוני קפסיד (hexon, בסיס פנטה, PIX ו / או סיבים) של אדנווירוס. נתון זה הותאם מNemerow et al., 2009 וירולוגיה 384 (2009) 380-388, זכויות יוצרים Elsevier. הבר (ב) ג'ין (HVR1-קוואס) הייתה מסונתזת ומשובטת לתוך וקטור PUC על ידי חברה. בר זה subcloned לפלסמיד ההסעות נבנה בעבר HVR5-6 / pH5S ידי הגבלת אנזימי AgeI וAccI ליצור HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S. פלסמיד ההסעות וכתוצאה מכך היה מתעכל עם האנזימים EcoRI וPmeI, ועם פלסמיד עמוד השדרה לינארית-שואי pAd5 / ΔH5 (GL), הפך לשותף רקומבינציה ההומולוגית, וכתוצאה מכך בדור של pAd5 פלסמיד עמוד השדרה recombined / H5-HVR1-קוואס -HVR5-6. בנתון זה, R1 מציין HVR1 וR5 מציין HVR5, וGL מציין חלבון ירוק הקרינה (GFP) וluciferase, בנפרד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הערכה של חשיפת אנטיגני של אנטיגנים המאוגדת על פני השטח קפסיד של הווקטור הנגיפי דו הערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 וקטור נגיפי שלם. ELISA בוצע כדי לקבוע אם אנטיגנים התאגדו נחשפו על וקטור משטח תוך שמירה על מאפייני אנטיגני משלהם. צלחות ELISA טויחו הווקטור דו הערכי, וטופחו עם אדם 2F5 מב (א) או אנטי-עכבר מב (B). הנתונים הצביעו על הכריכה המשמעותית של הנוגדנים לווקטור דו הערכי, אבל לא לוקטור שליטת Ad5. R1-קוואס-R5-6 מציין Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. ניתוח מערבי כתם בוצע כדי לאשר את אנטיגני המחייב של 2F5 מב האדם (C) או אנטי-עכבר מב (ד ') לאנטיגנים המאוגדת בווקטור דו הערכי. בשני (ג) ו- (ד), מסלול 1 מציין Ad5, ומסלול 2 מצביע Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הערכת יכולתו של הווקטור הנגיפי דו הערכי לברוח הנטרול על ידי Ad5-positve סרה במבחנה. Assay נטרול בוצעה על מנת לקבוע אם הווקטור דו הערכי יכול לברוח הנטרול. תוצאות הצביעו על נטרול וירוס Ad5 ידי סרה, אבל esשכמייה של נטרול הווירוס דו הערכי במבחנה. בנתון זה, R1-קוואס-R5-6 מציינים Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. הכוכביות *** מציין את ערך p <0.001.

איור 4
איור 4. בדור vivo של חסינות הלחות על ידי הווקטור הנגיפי דו הערכי במודל העכברים. סרה מבוססת ELISA שימש כדי להעריך את חסינות הלחות נגד החלבונים שולבו בווקטור דו הערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 . HIV-1 פפטיד () ו פפטיד (ב) היו מצופים בלוחות ELISA בנפרד, ואחריו הדגירה עם סרה העכברים משתי קבוצות החיסון (Ad5 וAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6) . הנתונים הצביעו על הדור המשמעותי של תגובות חיסוניות נגד הלחות אנטיגן HIV-1 בHVR1 () והתג שלו בHVR5 (B). כל נקודת נתונים מייצגת אמצעים וSD משמונה חזרות. הכוכביות *** מציינות את ערך p <0.001, ** מציין את ערך p <0.01, ו* מציין ערך p <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היישום של אסטרטגית transgene המסורתית על שינוי Ad5 לפיתוח של חיסונים כבר פחת בעיקר בשל צוואר הבקבוק הקשורים לAd5 PEI 4,6. צוואר בקבוק זה יכול להצטמצם באופן חלקי על ידי יישום של האסטרטגיה החלופית Antigen capsid על-התאגדות (איור 1 א), שכן אסטרטגיה זו יכולה להתחמק נטרול על ידי Ad5 nabs ידי החלפת epitopes נטרול של Ad5 עם אנטיגנים של עניין, ולהקל על הדור של חסינות חזקה לאנטיגנים של ריבית המשולב. במחקר זה, הדור של הווקטור הנגיפי דו הערכי שונה Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 הוצג כדוגמא רעיונית (איור 1). מתאים לסעיף 1.1.1 הפרוטוקול, הבר מסונתז בפלסמיד הורה מכיל החלפת גן קצרה gp41 HIV-1 באזור HVR1 של hexon5. גן gp41 החלקי מקודד epitope ELDKWAS, שמחליףHVR1 חלקי מחומצות אמינו 139-144 של hexon5 14. ELDKWAS הוא epitope נטרול חזק בHIV-1 gp41 19.

במהלך השיבוט, היו שני שלבים קריטיים. צעד אחד היה הבחירה של שני אנזימי הגבלה כאשר סינתזת עניין בר הגן בסעיף 1.1.1 הפרוטוקול. בחירתם של שני האנזימים בתנאים תלוי במיקום של קפסיד המודעות להיות שונה, כלומר., במחקר זה, שבר גן המכיל קוואס יועד לשלב HVR1 חלבון hexon5 של. הגבלת אנזימי AgeI וAccI קיימות בנפרד באיגוף N-מסוף ו- C-מסוף תחומי אזור HVR1, ולא קיימים בבר HVR1-קוואס, כך AgeI וAccI נבחרו להיות לשים בנפרד בN-הסופי וC- תחנה סופית של הבר מסונתז HVR1-קוואס. מאז hexon הוא היעד העיקרי של מודעות nabs, וhexon ספציפי epitopes נטרול מתגוררת בכל HVRs של hexon 12,18, זה אפשרי כי הוקטורי Ad5 דואר hexon שונה עם אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יוכל לקבל את היכולת לעקוף את הנטרול על ידי סרה Ad5 חיובית במבחנה, ואפילו PEI Ad5 במארח. במחקר זה, שתי HVR1 וHVR5 על הווקטור הנגיפי דו הערכי יכולים לתרום לבריחה של נטרול על ידי סרה Ad5-החיובית. השלב הקריטי האחר היה בסעיף 1.2.2 הפרוטוקול. לאחר O / הדגירה N של תערובת-שינה שיתוף על אגר LB, BJ5183 המושבות גדלו צריכה להיות באופן מיידי בתרבית LB הנוזלי לO / N, ופלסמידים צריכים להוציא מייד מתאי BJ5183 גם כן. מעכב את ההליכים צפויים להוביל לרקומבינציה ומוטציות הפוטנציאליות, מאז פלסמיד recombined בתאי BJ5183 הוא לא יציב. פלסמיד הנכון מרקומבינציה ההומולוגית צריך להפוך לDH5α על מנת לשמור על מיני הגנום יציבים ונכונים.

לאחר השיבוט, היו שני שלבים קריטיים יותר.הצעד ראשון בסעיף הפרוטוקול הוא על transfection. זה הכרחי כדי transfect פלסמיד עמוד השדרה מודעות recombined לתאים המבטאים Ad5 E1 (HEK293), אם פלסמיד עמוד השדרה הוא גן E1 נמחק. הצעד נוסף בסעיף 2.3 הפרוטוקול הוא על upscaling וירוס. ההליך הבסיסי לupscaling וירוס מלווה את העיקרון של upscaling וירוס הסטנדרטי מבקבוק T-25 ל- T-75 צלוחיות ול- T-175 צלוחיות. עם זאת מספר צלוחיות (T-75 ו / או T-175) לשימוש תלוי במהירות הצמיחה של הנגיף, פיתוח CPE נגרמים על ידי הזיהום בנגיף, ואת כמות נגיף צורך.

אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות מאפשרת ליישום רחב על שינויי מודעות. עם אסטרטגיה זו, זה אפשרי לשנות או לשלב אנטיגנים Heterologous על חלבונים שונים קפסיד גדולים, כגון hexon 2,4,20, בסיס פנטון 21 וסיבים 22. חלבון קטין קפסיד הסופי PIX C הראה גם הבטחה לheterolאנטיגן ogous / התאגדות פפטיד 21,23. מלבד השינוי אחד, שינויים מרובים במודעות עם אסטרטגיה זו גם זכו להצלחה. דוגמאות לכך הן הדור של דו ערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 במחקר זה על ידי התאגדות בשני HVR1 וHVR5 של hexon5, ושילוב של שני אפיטופים נטרול מסוג enterovirus 71 לאו HVR1 וHVR2 או HVR1 ו HVR4, או HVR1 וHVR5 של hexon3 24. דוגמאות אלה מצביעות על ההיתכנות של שינויי hexon בקפסיד אחרים של מודעות, לצורך או הריפוי גנטי או גישת חיסון. הנתונים שלנו גם הדגימו את ההתאגדות של שני אפיטופים cruzi Trypanosoma לhexon וPIX (נתונים שלא פורסמו). אסטרטגיה זו גם הורחבה לעשות וקטורי מודעות chimeric לאו חיסון או גישות ריפוי גנטי. דוגמאות לכך הן הדור של Ad5H3 chimeric על ידי מעבר hexon5 עם hexon3 16, הדור של Ad3H7 chimeric על ידי מיתוג Wi hexon3ה hexon7 25, והדור של Ad5F4 chimeric על ידי החלפת Ad5 סיבים עם סיבי Ad4 26.

במחקר זה, דו הערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 הפגינו לעורר תגובה חיסונית הלחות ספציפית לאנטיגנים של ריבית המשולב. הפרויקט הנוכחי שלנו מראה שתגובת תאי CD8 T ASP2 הספציפי ערוכה באופן משמעותי על ידי חיסון עם וקטור Ad5-PIX-ASP2, שנוצר על ידי שילוב של פפטיד ASP2 לIX חלבון (PIX) של Ad5, עם אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות (מידע לא מוצג). ASP2, גם בשם חלבון משטח amastigote 2, הוא אנטיגן immunodominant של cruzi Trypanosoma טפיל protozoan תאיים digenetic (ט cruzi) 27. ממצא הניסיוני חדש זו מרחיב את הידע שלנו כי היישום של אסטרטגית Antigen capsid על-התאגדות על חיסוני מודעות וקטורים יכול לעורר תגובה חיסונית הלחות לא רק, אלא גם immun הסלולריתגובות דואר ספציפיות לאנטיגנים של עניין.

למרות שיחסית יתרון אסטרטגית transgene המסורתי, אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יש גם שלושה חסרונות. ראשית, הוא לא יכול להרשות לשילוב של גן-של-עניין, כל עוד אסטרטגיה מסורתית עושה. זה כבר דווח כי אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות על hexon5 מאפשרת להוספות של חומצות אמינו 80 מקסימום (אא) בHVR1, 77 AA בHVR5 ו -57 AA בHVR2 2. מזה, HVR1 הוא המקום המתירני ביותר להתאגדות. עם זאת, PIX חלבון קפסיד הקטין יכול להכיל הכנסה של 1,000 חומצות אמינו 28. שנית, כמה אנטיגנים-של-עניין בטבע להיכשל בשילוב לתוך חלבוני קפסיד מודעות, בשל גורמים כגון חיובים וכוחות של חומצות אמינו, שנראים לשבש את ההסדר המבני של נגיף מודעות. במקרה זה, את ההקדמה של מפרידי מתאימים צמודה לאנטיגנים של הריבית עשוי לעזור ההתאגדות מוצלחת דואר 4. שלישית, התאגדות בכמה מקומות HVR, כלומר., HVR6 או HVR7 עלולה להוביל לדור הכושל של וקטורים ויראליים קיימא 12. בהתחשב ביתרונות והחסרונות של שני האסטרטגיות, בחירה נבונה משתי אסטרטגיות או שילוב של שניהם האסטרטגיות תהיה תלויה בתנאים / הצרכים הספציפיים. דוגמא לסירוק שני האסטרטגיות היא הדור של Ad5 / HVR2-MPER-L15 (GAG), לפי האזור החיצוני הקרום-הפרוקסימלי (MPER) של HIV-1 gp41was שולב HVR2 של hexon5 עם אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות, וHIV-1 גן Gag הוכנס להחליף את מיקום גן E1 של Ad5 עם אסטרטגית transgene המסורתית 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה 5T32AI7493-20 ו5R01AI089337-03. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Scientific SH30256.01 for cell spliting 
10x DPBS Thermo Scientific SH30378.02 for dialysis buffer preparation
glycerol SIGMA G5516-1L for dialysis buffer preparation
SDS BIO-RAD 161-0301 for virus lysis buffer preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific SH30910.03 component of culture medium
100x Non-Essential Amino Acids  Thermo Scientific SH30238.01 component of culture medium
200 mM L-glutamine Cellgro 25-005-CI component of culture medium
penicillin/streptomycin solution  Cellgro 30-002-CI component of culture medium
DMEM with high glucose Thermo Scientific SH30081.01 for HEK293 cell culture
Minimum Essential Medium Eagle SIGMA M5650 for HeLa cell culture
phenol:chloroform:isoamyl alcohol  SIGMA P3803-100ML for large size of DNA purification
cesium chloride  Research Products International Corp. C68050 for virus purificiation
HEPES Cellgro 25-060-CI for CsCl solution preparation
HEK293 ATCC 51-0036 for virus rescue and upscale
HeLa ATCC CCL-2 for neutralization assay
T-25 flask Thermo Scientific 156367 for cell culture 
T-75 flask CORNING 430641 for cell culture 
T-175 flask Thermo Scientific 159910 for cell culture 
Ultracentrifuge BECKMAN NA for virus purification
Ultracentrifuge tube BECKMAN 344059 for virus purification
dialysis cassette  Thermo Scientific 66380 for virus dialysis
ELISA plate Thermo Scientific 442404 for ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAb NIH AIDS Reagent Program 1475 for immunological assays
mouse anti-His tag mAb GenScript A00186 for immunological assays
SOC medium CORNING 46-003-CR for transformation
PCR master mix solution QIAGEN 201445 for PCR
Animal lancet (point length at 5 mm) MEDIpoint for mice bleeding 
Biophotometer Eppendorf for virus physical titer titration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Tags

אימונולוגיה גיליון 99 אסטרטגית Antigen capsid על-התאגדות שיטת transgene Adenovirus (מודעות) חיסון חלבוני קפסיד שינוי כפול חסינות מראש קיימות (PEI)
ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Farrow, A. L.,… More

Gu, L., Farrow, A. L., Krendelchtchikov, A., Matthews, Q. L. Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches. J. Vis. Exp. (99), e52655, doi:10.3791/52655 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter