Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l'aide d'un<em> Gaussia</em> Luciférase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Le réticulum endoplasmique (RE) contient le plus haut niveau de calcium intracellulaire, avec des concentrations d'environ 5000 fois plus élevée que les niveaux cytoplasmiques. Un contrôle serré sur ER calcium est impératif pour le repliement des protéines, la modification et la traite. Les perturbations à ER calcium peuvent conduire à l'activation de la réponse de la protéine dépliée, un mécanisme de réponse au stress du RE à trois broches, et contribuer à la pathogenèse d'une variété de maladies. La capacité de surveiller les modifications de calcium ER apparition et la progression au cours de la maladie est important en principe, mais difficile en pratique. Méthodes actuellement disponibles pour ER de surveillance de calcium, tels que les colorants et les protéines fluorescentes calcium-dépendante, ont permis de mieux comprendre la dynamique ER de calcium dans les cellules, mais ces outils ne sont pas bien adaptés pour des études in vivo. Notre laboratoire a démontré qu'une modification de l'extrémité carboxy-terminale de la luciférase de Gaussia confère sécrétion du rapporteur en réponse àER appauvrissement de calcium. Les procédés d'utilisation d'une luciférase en fonction, la protéine de surveillance de calcium du RE sécrétée (SERCaMP) pour in vitro et in vivo dans des applications sont décrits ici. Cette vidéo met injections hépatiques, la manipulation pharmacologique de GLUC-SERCaMP, la collecte et le traitement du sang, et les paramètres de dosage pour le suivi longitudinal de ER calcium.
Introduction
Le réticulum endoplasmique (RE) des fonctions dans de nombreuses capacités cellulaires, y compris le repliement des protéines, la sécrétion de protéines, l'homéostasie lipidique et de signalisation intracellulaire 1. Central à la fonction ER normale est de maintenir les concentrations de calcium luminal à ~ 5000 fois ceux trouvés dans le cytoplasme 2-4. Ce processus intensif d'énergie est réglementée par la ATPase Sarco / réticulum endoplasmique de calcium (SERCA), une pompe qui déplace des ions calcium dans le RE. Efflux de calcium du RE est principalement médiée par la ryanodine (RyR) et l'inositol triphosphate (IP3R) récepteurs. Parce que de nombreux processus de ER sont dépendantes du calcium, perturbant le magasin peut conduire à des stress du RE et la mort cellulaire éventuelle.
ER dysrégulation de calcium a été observée dans les maladies y compris la cardiomyopathie, le diabète, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et 5. En raison de la nature progressive de ces maladies, il a été difficile de délimiter la nouvelle cause à effetlation entre la pathogenèse et les modifications dans le magasin ER de calcium. Un certain nombre de technologies ont permis des avancées significatives dans notre compréhension de la dynamique ER de calcium, y compris les colorants et les indicateurs de calcium génétiquement codés (GeCIS). Des colorants à faible affinité de calcium, ce qui augmente la fluorescence lorsqu'il est lié à Ca2 +, peuvent être chargées dans les cellules à examiner compartiments subcellulaires avec des concentrations élevées de calcium 6. GeCIS, comme D1ER et le receveur permettre un suivi des fluctuations de calcium avec un contrôle plus précis de la localisation subcellulaire 7-9. Récemment, une autre classe de GECIS appelés indicateurs de protéines organelles piégée calcium de mesure (CEPIA) ont été décrits 10. Une troisième approche combinant la génétique et la chimie des petites molécules ciblé est-estérase charge de colorant (TED), qui utilise une carboxylestérase codé génétiquement (ciblé pour l'ER) avec un colorant à base d'ester de calcium-11.
Bien que la aforementioned approches ont des forces et des faiblesses inhérentes, ils peuvent fournir des informations précieuses sur la dynamique de calcium ER par des mesures aigus de fluorescence. Ils sont, cependant, pas optimal pour les études longitudinales souvent nécessaires pour enquêter sur la progression de la maladie. Dans le but de mettre au point une méthode pour surveiller la dynamique de calcium sur des périodes de temps prolongées, nous avons identifié et développé une modification des protéines pour créer les protéines sécrétées de calcium ER surveillance (SERCaMPs) 12.
SERCaMP contourne plusieurs limitations associées avec d'autres méthodes, en fournissant une approche minimalement invasive pour interroger plusieurs reprises la boutique ER de calcium. Nous avons précédemment démontré que le peptide ASARTDL carboxy-terminale (alanine-sérine-arginine-alanine-thréonine-leucine-acide aspartique) est suffisante pour favoriser la rétention au ER; cependant, dans des conditions qui causent des diminutions de calcium ER, la séquence peptidique est plus en mesure de maintenir ER localization et la protéine est sécrétée 13. La base de la technologie de SERCaMP est l'appendice de ASARTDL à l'extrémité carboxy-terminale d'une protéine sécrétée (par exemple, la luciférase de Gaussia, ou Gluc) de telle sorte que la sécrétion est déclenchée par épuisement ER de calcium, créant ainsi un journaliste robuste de ER dysrégulation de calcium 12. L'expression de Gluc-SERCaMP par des méthodes transgéniques permet fluides biologiques, notamment milieu de culture de cellules et le plasma à analyser les changements dans l'activité Gluc comme indicateur de l'homéostasie de calcium ER. La méthode a des applications pour l'étude longitudinale des modifications progressives dans le magasin de calcium ER la fois in vitro et in vivo. Le protocole suivant est écrit comme un cadre général pour l'aide basée SERCaMP-GLUC pour étudier ER homéostasie du calcium, mais le protocole peut servir de guide pour SERCaMPs rapporteurs alternatives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole met en évidence de vitro et in vivo de l'utilité de Gluc-SERCaMP pour contrôler l'épuisement de calcium ER. Bien que la modification de la protéine pour générer SERCaMP semble généraliser à d'autres 12 protéines rapporteurs, nous avons choisi pour la luciférase de Gaussia son robuste (200-1,000 fois supérieure) bioluminescence par rapport aux autres luciférases 18. Nous démontrons détectable induite thapsigargine GLUC-SERCaMP libé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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