ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em> Gaussia</em> לוציפראז SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Reticulum endoplasmic (ER) מכיל את הרמה הגבוהה ביותר של סידן תוך תאי, עם ריכוזים כ -5,000 פי יותר מרמות cytoplasmic. פיקוח הדוק על סידן ER הכרחי לקיפול חלבונים, שינוי וסחר. הפרעות לסידן ER יכולות לגרום להפעלה של תגובת החלבון מקופלת, מנגנון תגובת לחץ ER שלוש שיניים, ותורמות לפתוגנזה במגוון רחב של מחלות. היכולת לעקוב אחר שינויי סידן ER במהלך התפרצות מחלה והתקדמות חשובה בעיקרון, אך מאתגרת בפועל. שיטות זמינות כעת עבור סידן ER הניטור, כגון צבעי ניאון סידן תלוי וחלבונים, סיפקו תובנה דינמיקת סידן ER בתאים, אולם הכלים אלה אינם מתאימים ללימודים בvivo. המעבדה שלנו הוכיחה ששינוי לcarboxy-הסופית של לוציפראז Gaussia מקנה הפרשת הכתב בתגובה לדלדול סידן ER. השיטות לשימוש בלוציפראז מבוסס, חלבון ניטור סידן מופרש ER (SERCaMP) במבחנה וביישומי vivo מתוארות במסמך זה. וידאו זה מדגיש זריקות כבד, מניפולציה תרופתית של GLuc-SERCaMP, איסוף דם ועיבוד, ופרמטרי assay לניטור אורך של סידן ER.
Introduction
Reticulum endoplasmic (ER) פונקציות רבות יכולות סלולריות כוללים קיפול חלבונים, הפרשת חלבון, שומנים הומאוסטזיס, ואיתות תאית 1. מרכז לתפקוד נורמלי ER הוא שמירת ריכוזי סידן luminal ב ~ 5000 פעמים אלה שנמצאו בציטופלסמה 2-4. תהליך עתיר אנרגיה זה מוסדר על ידי ATPase סידן Sarco / reticulum endoplasmic (SERCA), משאבה שזז יוני סידן לחדר המיון. זרימה של סידן מחדר המיון מתווכת בעיקר על ידי ryanodine (RyR) וקולטני אדנוזין אינוזיטול (IP3R). בגלל תהליכי מיון רבים תלויים בסידן, לשבש את החנות יכולה להוביל ללחץ ER ומוות של תאי סופו של דבר.
ER חוסר ויסות הסידן נצפה במחלות כולל קרדיומיופתיה, סוכרת, אלצהיימר, פרקינסון ושל 5. בשל הפרוגרסיביות של מחלות אלו, זה כבר מאתגר להתוות סיבה והתוצאה מחדשlationship בין פתוגנזה ושינויים בחנות סידן ER. מספר הטכנולוגיות איפשר להתקדמות משמעותית בהבנה של דינמיקת סידן ER, כוללים צבעים ואינדיקטורים מקודדים גנטיים סידן (GECIs) שלנו. צבעים נמוכים זיקת סידן, המגדילים בקרינה כאשר חייב Ca 2 +, ניתן לטעון לתאים לבחון תאי subcellular עם ריכוזים גבוהים של סידן 6. GECIs, כגון D1ER ותופס לאפשר ניטור של תנודות סידן עם שליטה מדויקת יותר של לוקליזציה subcellular 7-9. לאחרונה, סוג אחר של GECIs נקראים אינדיקטורים למדידת סידן בפח אברון חלבון (CEPIA) תוארו 10. גישה שלישית המשלבת גנטיקה וכימיה מולקולה קטנה הוא טעינת צבע הממוקד-אסטראז (TED), אשר מנצל carboxylesterase מקודדים גנטי (ממוקד לחדר המיון) עם צבע סידן מבוסס אסתר 11.
בעוד המגייסיש גישות ementioned נקודות חוזק וחולשה טבועים, הם יכולים לספק תובנה חשובה דינמיקת סידן ER באמצעות מדידות של הקרינה אקוטיות. הם, לעומת זאת, לא אופטימליים למחקרים ארוכי טווח לעתים קרובות נדרשו לחקור את התקדמות מחלה. במטרה להמציא שיטה לעקוב אחר דינמיקת סידן על פני תקופות זמן ארוכות, זיהינו ופיתחנו שינוי חלבון ליצירת חלבוני סידן מופרש ER ניטור (SERCaMPs) 12.
SERCaMP עוקף כמה מגבלות הקשורות לשיטות אחרות, על ידי מתן גישה פולשנית לחקור חנות סידן ER שוב ושוב. אנחנו הוכחנו בעבר כי ASARTDL carboxy מסוף פפטיד (אלאנין-סרין-אלאנין-ארגינין-תראונין-אספרטית חומצה-לאוצין) מספיק כדי לקדם את שימור ER; עם זאת, בתנאים שגורמים לירידות בסידן ER, רצף הפפטיד הוא כבר לא מסוגל לשמור על localizatio ERn והחלבון מופרש 13. בסיס טכנולוגית SERCaMP הוא התוספת של ASARTDL לcarboxy-הסופית של חלבון מופרש (לוציפראז למשל Gaussia, או GLuc) כך שההפרשה מופעלת על ידי דלדול סידן ER, ובכך ליצור כתב חזק של חוסר ויסות הסידן ER 12. הביטוי של GLuc-SERCaMP באמצעות שיטות מהונדסים מאפשר נוזלים ביולוגיים כוללים תרבית תאים בינוני ופלזמה להיות מנותח לשינויים בפעילות GLuc כאינדיקטור של הומאוסטזיס סידן ER. יש שיטת בקשות למחקר האורך של שינויים הדרגתיים בחנות סידן ER הן במבחנה in vivo. הפרוטוקול הבא נכתב כמתווה כללית לשימוש SERCaMP מבוסס GLuc ללמוד הומאוסטזיס סידן ER, אבל הפרוטוקול יכול לשמש כמדריך לSERCaMPs כתב חלופי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגיש במבחנה ובשירות vivo של GLuc-SERCaMP לפקח דלדול סידן ER. למרות שינוי החלבון כדי ליצור SERCaMP מופיע להכליל לחלבוני כתב אחרים 12, בחרנו בלוציפראז Gaussia לפליטת האור שלו חזק (200-1,000 הגדול יותר פי) בהשוואה לluciferases האחר 18. אנו מדגימים שחרור GLuc-SERCaMP זיה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
