Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em> Gaussia</em> Luciferasi SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Il reticolo endoplasmatico (ER) contiene il più alto livello di calcio intracellulare, con concentrazioni di circa 5000 volte superiore a livelli citoplasmatici. Stretto controllo sulla ER calcio è un imperativo per ripiegamento proteico, la modifica e il traffico. Perturbazioni ER calcio può provocare l'attivazione della risposta unfolded proteina, un meccanismo di risposta allo stress ER tre poli, e contribuire alla patogenesi di varie malattie. La capacità di monitorare alterazioni ER calcio durante l'insorgenza e la progressione della malattia è importante in linea di principio, ma stimolante in pratica. Metodi attualmente disponibili per monitorare ER calcio, come coloranti e proteine fluorescenti calcio-dipendente, hanno fornito visione dinamica ER calcio nelle cellule, tuttavia questi strumenti non sono adatti per gli studi in vivo. Il nostro laboratorio ha dimostrato che una modifica al carbossi-terminale della luciferasi Gaussia conferisce la secrezione del reporter in risposta aER deplezione di calcio. I metodi per l'utilizzo di una base luciferasi, ER secreta proteina monitoraggio calcio (SERCaMP) in vitro e per applicazioni in vivo sono qui descritti. Questo video mette in evidenza le iniezioni epatiche, manipolazione farmacologica del GLUC-SERCaMP, la raccolta e il trattamento del sangue, e parametri del test per il monitoraggio longitudinale ER calcio.
Introduction
Il reticolo endoplasmatico (ER) funzioni in molte capacità cellulari tra cui il ripiegamento delle proteine, la secrezione di proteine, lipidi omeostasi, e intracellulare di segnalazione 1. Centrale alla funzione ER normale è mantenere le concentrazioni di calcio luminali in ~ 5.000 volte quelli trovati nel citoplasma 2-4. Questo processo intensità energetica è regolata dalla ATPasi sarco / reticolo endoplasmatico calcio (SERCA), una pompa che si muove ioni calcio al pronto soccorso. Passaggio di calcio dalle ER è mediato principalmente dal rianodina (RyR) e trifosfato inositolo (IP3R) recettori. Poiché molti processi ER dipendono calcio, interrompendo il negozio può portare a ER stress e la morte delle cellule.
ER disregolazione del calcio è stata osservata in malattie tra cui cardiomiopatia, diabete, morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e 5. A causa della natura progressiva di queste malattie, è stato impegnativo per delineare la causa-effetto rerappor- tra la patogenesi e alterazioni del negozio ER calcio. Un certo numero di tecnologie hanno permesso significativi progressi nella nostra comprensione delle dinamiche ER calcio, compresi i coloranti e gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS). Coloranti di calcio a bassa affinità, che aumentano di fluorescenza quando si lega a Ca 2+, possono essere caricati in cellule per esaminare compartimenti subcellulari con elevate concentrazioni di calcio 6. GeCIS, quali D1ER e catcher consentire un monitoraggio delle fluttuazioni di calcio con un controllo più preciso della localizzazione subcellulare 7-9. Recentemente, un'altra classe di GECIS chiamati indicatori di proteine organelli-intrappolato-calcio misura (Cepia) sono stati descritti 10. Un terzo approccio che combina la genetica e la piccola molecola chimica è mirata-esterasi dye carico (TED), che utilizza un carbossilesterasi geneticamente codificato (mirato al pronto soccorso), con un calcio di colorante a base di estere-11.
Mentre il aforapprocci ementioned hanno punti di forza e debolezze intrinseche, possono fornire informazioni preziose dinamiche di calcio ER attraverso misure acuti di fluorescenza. Sono, tuttavia, non è ottimale per gli studi longitudinali spesso necessarie per determinare la progressione della malattia. Con l'obiettivo di escogitare un metodo per monitorare dinamiche di calcio per periodi di tempo prolungati, abbiamo identificato e sviluppato una modifica proteina per creare le proteine secrete calcio ER supervisione (SERCaMPs) 12.
SERCaMP elude diversi limiti associati con altre metodologie, fornendo un approccio mini-invasivo per interrogare più volte il negozio ER calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il peptide ASARTDL carbossiterminale (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-aspartico-leucina) è sufficiente a favorire la ritenzione ER; Tuttavia, in condizioni che causano diminuzioni ER calcio, la sequenza di peptidi non è più in grado di trattenere ER localization e la proteina è secreta 13. La base della tecnologia SERCaMP è l'appendice di ASARTDL al carbossi-terminale di una proteina secreta (es Gaussia luciferasi o Gluc) tale che la secrezione è innescato dalla deplezione ER calcio, creando così un robusto giornalista di ER calcio disregolazione 12. L'espressione di GLUC-SERCaMP tramite metodi transgenici permette fluidi biologici tra cui coltura cellulare di medio e di plasma da analizzare per i cambiamenti nell'attività GLUC come indicatore dell'omeostasi ER calcio. Il metodo ha applicazioni per lo studio longitudinale alterazioni progressive nell'archivio calcio ER sia in vitro che in vivo. Il protocollo che segue è scritto come un quadro generale per l'uso di base-GLUC SERCaMP studiare ER calcio omeostasi, ma il protocollo può servire come guida per SERCaMPs giornalista alternative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo evidenzia de vitro e in vivo di utilità Gluc-SERCaMP monitorare deplezione di ER calcio. Anche se la modifica della proteina di generare SERCaMP sembra generalizzare ad altre proteine reporter di 12, abbiamo scelto Gaussia luciferasi per la sua robustezza (200-1.000 volte maggiore) bioluminescenza rispetto agli altri luciferasi 18. Dimostriamo rilevabile tapsigargina indotta rilascio GLUC-SERCaMP attraverso un range di dosaggio 100 volte virus GLU…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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