Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em> Gaussia</em> Luciferase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
O retículo endoplasmático (ER) contém o mais alto nível de cálcio intracelular, com concentrações de aproximadamente 5000 vezes maior do que os níveis citoplasmáticos. Um controlo apertado sobre ER cálcio é imprescindível para o dobramento de proteínas, modificação e tráfico. Perturbações para Er cálcio podem resultar na activação da resposta proteína desdobrada, um mecanismo de resposta de stress do ER de três pinos, e contribuir para a patogénese de uma variedade de doenças. A capacidade de controlar alterações ER cálcio durante o início e progressão da doença é importante, em princípio, no entanto, um desafio na prática. Métodos actualmente disponíveis para o monitoramento ER cálcio, tais como corantes e proteínas fluorescentes dependentes de cálcio, têm fornecido uma visão sobre a dinâmica ER cálcio nas células, porém essas ferramentas não são adequados para estudos in vivo. O nosso laboratório demonstrou que uma modificação para o terminal carboxi de Gaussia luciferase confere secreção do repórter em resposta aDepleção de cálcio ER. Os métodos para a utilização de uma base de luciferase, proteína secretada ER monitorização de cálcio (SERCaMP) de vitro e in vivo em aplicações são aqui descritos. Este vídeo destaca injeções hepáticas, manipulação farmacológica de Gluc-SERCaMP, coleta e processamento do sangue e os parâmetros de ensaio para acompanhamento longitudinal de ER cálcio.
Introduction
O funções em muitas capacidades celulares, incluindo o dobramento de proteínas, a secreção de proteínas, a homeostase lipídica e de sinalização intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central para a função ER normal é manter as concentrações de cálcio luminais em ~ 5.000 vezes aqueles encontrados no citoplasma 2-4. Este processo intensivo de energia é regulada pela ATPase sarco / retículo endoplasmático de cálcio (SERCA), uma bomba que move íons de cálcio para o ER. O efluxo de cálcio do RE é mediada principalmente pela rianodina (RyR) e trifosfato de inositol (IP3R receptores). Uma vez que muitos processos de ER são dependentes de cálcio, interrompendo o armazenamento pode levar ao estresse ER e eventual morte celular.
ER desregulação de cálcio tem sido observada em doenças, incluindo cardiomiopatia, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e 5. Devido à natureza progressiva destas doenças, tem sido um desafio para delinear a causa-efeito relação entre patogênese e alterações na loja ER cálcio. Uma série de tecnologias têm permitido avanços significativos em nossa compreensão da dinâmica ER cálcio, incluindo corantes e indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis). Corantes de cálcio de baixa afinidade, que aumentam em fluorescência quando ligados a Ca2 +, podem ser carregados em células para examinar compartimentos subcelulares com elevadas concentrações de cálcio 6. Gecis, tal como Catcher D1ER e permitir o monitoramento das flutuações de cálcio com um controle mais preciso da localização subcelular 7-9. Recentemente, uma outra classe de Gecis chamados indicadores de proteína encapsulada em organelo medição de cálcio (cepia) foram descritos 10. Uma terceira abordagem combinando genética e pequena molécula química é-esterase alvo corante de carga (TED), que utiliza um carboxilesterase geneticamente codificado (voltado para o ER) com um corante à base de cálcio éster 11.
Enquanto o AFORementioned abordagens têm forças e fraquezas inerentes, podem fornecer informações valiosas sobre a dinâmica do cálcio ER através de medições agudos de fluorescência. Eles são, no entanto, não é óptima para os estudos longitudinais muitas vezes necessários para investigar a progressão da doença. Com o objectivo de conceber um método para controlar a dinâmica de cálcio durante grandes períodos de tempo, foram identificados e desenvolvida uma modificação da proteína para criar as proteínas secretadas de monitorização de cálcio ER (SERCaMPs) 12.
SERCaMP contorna várias limitações associadas com outras metodologias, através de uma abordagem minimamente invasiva para interrogar repetidamente o armazenamento de cálcio ER. Temos anteriormente demonstrado que o péptido carboxi-terminal ASARTDL (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-leucina-ácido aspártico) é suficiente para promover a retenção no ER; no entanto, em condições que causam decréscimos em ER de cálcio, a sequência do péptido não é mais capaz de reter ER localization e a proteína é secretada 13. A base da tecnologia SERCaMP é o apêndice da ASARTDL ao terminal carboxi de uma proteína segregada (por exemplo, luciferase Gaussia, ou Gluc) de tal modo que a secreção é desencadeada pela depleção de cálcio ER, criando, assim, um repórter robusta de ER desregulação de cálcio 12. A expressão de glic-SERCaMP através de métodos transgénicos permite fluidos biológicos, incluindo meio de cultura celular e de plasma para ser analisado para alterações na actividade gluc como um indicador da homeostase do cálcio ER. O método tem aplicações para o estudo longitudinal de alterações progressivas na loja ER cálcio tanto in vitro como in vivo. O protocolo seguinte é escrito como um esboço geral para a utilização de base SERCaMP-Gluc para estudar a homeostase do cálcio ER, mas o protocolo pode servir como um guia para SERCaMPs repórter alternativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo destaca o in vitro e in vivo da utilidade glic-SERCaMP para monitorar a depleção de cálcio ER. Embora a modificação de proteínas para gerar SERCaMP parece generalizar a outras proteínas repórter 12, optamos Gaussia luciferase por sua robusta (200-1.000 maior vezes) bioluminescência em comparação com outras luciferases 18. Nós demonstramos detectável libertação induzida por thapsigargin Gluc-SERCaMP através de uma gama de doses 100 vezes de vírus Glu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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