Protocol
1. Purificación de la GTPasa GST-etiquetados
- Cultura una E. cepa de E. coli tales como BL21 transformadas con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, en 500 ml de medio de autoinducción (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucosa, 0,2% de lactosa, 5 g de triptona, 2,5 g extracto de levadura, 100 mg / ml de ampicilina).
- Cosecha bacterias por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg, 4 ° C.
- Resuspender sedimento bacteriano en 20 ml de reactivo de extracción de proteínas, inhibidor de la proteasa 1x y se incuba durante 20 min a TA con inversión.
- Aclarar el lisado por centrifugación a 40.000 xg durante 30 min.
- Añadir perlas magnéticas 2 ml de glutatión, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).
- Incubar durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C.
- Lavar perlas de proteína cargada por cuatro veces con 10 ml de PBS, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso.
- Resuspender perlas en 2 ml de PBS y tienda de proteína cargada-a -80 ° C en 100 ml de alícuotas hasta que se necesite.
2. Expresión de proteínas de unión a GTPasa-
- El día antes del experimento, los plásmidos que codifican transfectar proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados versiones de cada proteína de unión GTPasa en una separada de 75 cm 2 frasco de HEK293T como sigue. Para la validación de la carga de nucleótidos, marcado con GFP transfectar TrioD1 en una tercera de 75 cm 2 frasco de HEK293T.
- Diluir polyethylamine a 1 mg / ml en 100 l estéril NaCl 150 mM.
- Añadir 27 l polyethylamine diluido a 223 l de suero reducido de medios de comunicación.
- Añadir 12 g de ADN plasmídico a 250 l de suero reducido de medios de comunicación.
- Incubar cada tubo durante 2 minutos a RT. Combinar el polyethylamine y el ADN se mezcla en un solo tubo y agitar durante 2 min.
- Incubar durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.
- Reemplazar los medios de crecimiento (medio Eagle modificado por Dulbecco, 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, sin antibióticos) en 90% confluentes HEK293T con 5 ml de medio de crecimiento fresco.
- Añadir la mezcla de polyethylamine / ADN combinado al matraz y se incuba O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Purificación de proteínas de unión a GTPasa-
- Enjuague frascos de células transfectadas en PBS y drene matraz durante 5 minutos, aspirar líquido libre.
- Raspe células en 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibidor de la proteasa) en tubo de microcentrífuga.
- Lisar células mediante la mezcla por inversión a 4 ° C durante 30 min.
- Durante la lisis, lavar dos lotes de 40 mu l perlas de GFP-TRAP tres veces con tampón de lisis fresco, perlas sedimentan en 2700 xg durante 2 min entre lavados.
- Aclarar los lisados por centrifugación a 21.000 xg durante 10 min.
- Transferencia aclaró lisado de cada una de las proteínas de la competencia para separar las perlas lavadas GFP-trampa y permiten proteínas GFP-fusión que se unen durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C. Mantenga lisado de células GFP-TrioD1 en hielo.
- Lavar perlas de GFP-TRAP cargados dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), NaCl 50 mM, 0,7% (w / v) de Nonidet P-40 y dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 2 , sedimentación cuentas a 2700 xg durante 2 minutos entre lavados.
- Eluir proteínas de fusión GFP-mediante la adición de 40 l 0,2 M glicina (pH 2,5) y pipeteando arriba y abajo durante 30 segundos. Cuentas inmediatamente los sedimentos a 21.000 xg durante 60 s y traslade el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 4 l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Haga esto rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada.
- Analizar 1 l de cada proteína purificada por Western blot y la sonda con un anticuerpo anti-GFP para establecer rendimiento relativo usando un blott cuantitativasistema ing según el protocolo del fabricante. Alternativamente, determinar las concentraciones de proteínas por ácido (BCA) de ensayo bicinconínico pero esto introduce errores si las proteínas no reaccionan con el ensayo de una manera idéntica o hay proteínas contaminantes.
- Igualar la concentración de proteínas molar mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2.
4. nucleótidos carga de GTPasa
- Descongelar una alícuota de perlas magnéticas GST-Rac1, preparado en el paso 1.
- Tomar 90 l de perlas de GST-Rac1 y lavar tres veces con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso.
- Tampón Aspirar a partir de perlas y añadir 100 l 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM.
- De acuerdo a si el PIB, GTP o ninguna carga de nucleótidos se requiere para el experimento de competición, añadir 12 l PIB 100 mM, 12 mM l gu 10anosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTP? S) o no nucleótidos a 60 mu l perlas de GST-Rac1.
- Para los controles de nucleótidos de carga, dividir las perlas restantes en tres alícuotas de 10-mu l y añadir 2 l PIB mM 100, 2 l 10 mM GTP? S o ninguna de nucleótidos a cada tubo.
- Incubar las mezclas de perlas durante 30 minutos a 30 ° C con agitación.
- Estabilizar Rac1 de nucleótidos unida por la adición de 1 M MgCl 2: 3 l a la mezcla experimental (paso 4,4), 0,5 mu l a cada una de las mezclas de control (paso 4.5).
5. Competencia vinculante.
- Configure 6 tubos de microcentrífuga, conteniendo cada uno:
200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2
10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7)
Proteína 5 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante) - A cada tubo, añadir unión Rac1-0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l de proteína B (proteína de unión variable). Estos volúmenes asumen unaproximadamente pueden necesitar ser ajustado concentraciones madre iguales de las proteínas de unión constantes y variables y.
- Ajuste el volumen de proteínas de unión A y B si hay grandes diferencias en las afinidades de unión de las dos proteínas y esto debe determinarse empíricamente a través de las repeticiones experimentales. Completar el volumen total de la mezcla de unión a 235 l mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2.
- Establecer un tubo de microcentrífuga que contiene:
200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2
10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7)
Proteína 10 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante) - Configure el PIB, GTPyS y no hay tubos de control de nucleótidos:
200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2
10 cuentas de Rac1 de control mu l cargados en el paso 4.5 con el PIB, GTPyS o ninguna de nucleótidos y se estabilizaron en el paso 4.7.
180 l HLisado EK293T GFP-TrioD1, preparado como en el paso 3.6
4 l 1 M de MgCl 2 - Incubar la mezcla durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C.
- Lavar las perlas tres veces con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2.
- Eluir con destino proteínas en 20 l tampón de muestra reductor (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol).
6. Análisis de la competencia
- Resolver 10 l de la proteína unida (paso 5.6) por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y Western blot.
- Incubar la membrana a 4 ° CO / N en anticuerpo anti-GFP diluyó 1/1000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20 para detectar tanto de las proteínas de unión a GTPasa-etiquetados.
- Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20.
- Incubar la membrana durante 30 min a TA en DyLight 800 sec-conjugado anti-conejoanticuerpo secundaria, se diluyó 1 / 10.000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20.
- Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20.
- Analiza la membrana usando un sistema de imagen de infrarrojos, utilizando el software para medir la intensidad de la banda de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Trazar la intensidad de la banda de cada proteína en función del volumen del competidor variable (proteína B).
- Divida el volumen de competidor variable al punto en el que las líneas se cruzan por el volumen de competidor constante (Proteína A, 5 l) para determinar la relación de competidor a la cual se alcanza el equilibrio.
- Para la validación de la condición de nucleótidos de carga, las membranas de la sonda de p21-quinasa activada 1 (PAK1) (un efector) y GFP-TrioD1 (un FMAM), como se describe en los pasos 6.1-6.6.
Representative Results
Este protocolo está diseñado para calcular las afinidades relativas de los socios de unión para Rac1, sin la necesidad de conocer la concentración exacta de los competidores (Figura 1). Determinación de la concentración de proteína introduce errores y cuando se considera la competencia entre las moléculas en una vía de señalización no es necesario. Sin embargo, es importante saber que los dos competidores tienen la misma concentración molar en las soluciones madre para permitir relaciones simples para ser calculada cuando la adición de diferentes volúmenes para el ensayo. 40 l de perlas de GFP-TRAP tienen una capacidad de unión de ~ 300 pmol por lo que un confluente 75 cm 2 frascos de altamente células que expresan saturará los granos, con el resultado de que las preparaciones de las dos proteínas de unión diferentes serán similares antes del ajuste (Figura 2A). Si una de las proteínas expresa pobremente, este problema se puede superar mediante la purificación de que la proteína de más de un matraz de células.
8 (Figura 2B). GEFs unirse preferentemente al nucleótido libre de GTPasa para estabilizar el estado de transición. Como GEFs son de baja abundancia, por lo general inactivo y con frecuencia blot mal, es mejor que sobreexpresan un FMAM o fragmento del FMAM a prueba GTPasa nucleótidos libres. Con frecuencia usamos la primera homología Dbl de Trio, expresado como una fusión GFP (GFP-TrioD1 9) (Figura 2B) pero cualquier FMAM iba a funcionar. Las proteínas que se unen a la GTPasa PIB cargadas son más raros. Recientemente hemos informado de rcc2 como una de esas proteínas 7, o el PIB de carga puede ser validado simplemente como binding a ni GEF ni efector.
La salida del experimento será una transferencia Western que representa las dos parejas de unión GFP-etiquetados unidos a la GTPasa. Mediante el uso de un único anticuerpo para detectar ambas proteínas, las concentraciones a las que cantidades similares de ambos competidores se unen pueden ser determinados y por lo tanto las afinidades relativas reales. En este ejemplo, la competencia entre el dominio de la hélice de la proteína Rac1 la trata, coronin-1C (Rac1-proteína de unión a A), y la proteína Rac1-secuestro, rcc2 (Rac1-proteína de unión B), se demuestra (Figura 3A). Mediante el uso de un volumen constante de la hélice coronin-1C (5 l), y la adición de volúmenes crecientes de rcc2, podemos ver de la GFP blot que el equilibrio se alcanza a 1,25-2,5 l de rcc2 (asterisco), lo que demuestra que tiene un fuerte rcc2 afinidad por Rac1 que coronin-1C. Mediante la medición de la intensidad de las bandas utilizando transferencia Western cuantitativa, y el trazado de los valores medios para cada competitor, el punto de equilibrio se puede calcular con precisión mediante la identificación de los volúmenes en el que las curvas se cruzan (Figura 3B).
Uno de los posibles obstáculos para un ensayo de competición éxito es si las parejas de unión se unen entre sí, así como la unión a Rac1. En la Figura 3A + B se demuestra la competencia entre rcc2 y el dominio de la hélice de coronin-1C, en lugar de larga duración coronin-1C. La razón para usar el coronin truncada es que coronin-1C también se une rcc2 a través del dominio de la cola. Cuando de larga duración coronin-1C se valora contra rcc2, se detecta la unión de ambas proteínas, debido a la formación ternario complejo, en lugar de la competencia (Figura 3C). Si la competencia se está produciendo, la unión de una proteína aumentará, mientras que la otra disminuye, y total unida GFP-fusión se mantendrá constante. En los casos en que se forma un complejo ternario es necesario truncar una de la proteína de unión a GTPasa de modo que la competITORS ya no interactúan.
Figura 1. Flujo de trabajo. Representación esquemática del flujo de trabajo para determinar la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Validación de proteínas purificadas. (A) purificada GFP-etiquetados Rac1 proteínas analizadas por Western blot de unión, sondando con anti-GFP para determinar el rendimiento relativo de las dos proteínas. Este tipo de ecualización durante el experimento permite la concentración de las dos proteínas que se puede modificar para que coincidan en el experimento de unión. (B) GDP, GTPyS y ningún nucleótido-cargado GST-Rac1 se incubó con lisado de HEK293T que expresan GFP-TrioD1 y proteínas detectadas por el trazado de PAK1 endógena o sobreexpresado GFP-TrioD1 obligados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Western blot de proteína en relación vinculante. Salidas Ejemplo de ensayos de unión con la competencia. Cargó-PIB (A) Rac1 se mezcló con 5 l GFP-coronin-1C dominio hélice y el aumento de los volúmenes de las buenas prácticas agrarias-rcc2 se valora en. Por Western Blot proteínas unidas para GFP, problemas con la detección diferencial de las dos proteínas se evitan y la señal de GFP informes de la relación molar entre las dos proteínas de fusión. Los asteriscos indican las relaciones de competencia en eithelado r del punto de equilibrio. (B) Banda intensidades de proteínas de fusión GFP encuadernados de tres experimentos independientes se midieron mediante transferencia Western cuantitativa, usando anticuerpos y promedios secundarios fluoróforo conjugado conspiraron para calcular la cantidad de rcc2 necesario para alcanzar el equilibrio. (C ) Ejemplo de salida de un experimento donde las proteínas de unión a Rac1 se unen entre sí y forman un complejo ternario, en lugar de competir. PIB-cargado Rac1 se mezcló con 5 l GFP-rcc2 y volúmenes crecientes de-GFP coronin-1C de larga duración se titularon. El aumento de la cota GFP-coronin-1C sin pérdida de cota GFP-rcc2 indica la formación del complejo ternario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
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