A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
عامل النسخ أعرب بتواجد مطلق وجوهري إنترفيرون (IFN) عامل التنظيمي 3 (IRF3) هو أمر حاسم لخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض أساسا من خلال تحريض IFNβ، ولكن أيضا من خلال تحريض على chemokine (CC عزر) يجند 5 (CCL5 ) والعديد من البروتينات المضادة للفيروسات بما في ذلك البروتين IFN التي يسببها مع tetratricopeptide يكرر IFIT1 / 2/3 1-3. تم الإبلاغ عن تفعيل IRF3 العدوى التالية مع العديد من الفيروسات أو التعرض لحمض polyinosinic-polycytidylic (بولي I: C) أو lipopolysaccharide في (LPS) 4. الأهم من ذلك، تطورت الفيروسات الأكثر دراسة آليات للتهرب من الاستجابة بوساطة IRF3، وبالتالي الهروب من المضيف الدفاع المناعي الفطري 5. وهكذا، ورصد تفعيل IRF3 له أهمية كبيرة لفهم الآليات الجزيئية للالفطري دفاع المضيف المضادة للفيروسات، ولكن أيضا لتحديد استراتيجية تستخدمها الفيروسات للتصدي لهذا الرد.
والأنف والحنجرة "> لكن العديد من التقارير المنشورة لا توفر سوى تحليل محدود من تفعيل IRF3 التي يؤديها رصد تحريض الجينات IRF3 المستهدفة (IFNB1 وIFIT1) و / أو مراسل luciferase الفحص الجيني بالإضافة إلى دقة منخفضة الصوديوم هلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS- PAGE) تحليل IRF3. ومع ذلك، العديد من الدراسات البيوكيميائية، ساهمت تحليل سلوك مختلف المسوخ IRF3 وتوضيح هيكل IRF3 الكريستال 11/06 لإثبات أن IRF3 يخضع لمجموعة معقدة من التعديلات بعد متعدية متتابعة من قبل الفسفرة في مواقع متعددة. ويبدو أن مجموعة من الفسفرة المشاركة في تفعيل IRF3 أن تعتمد على التحفيز وعلى الأرجح على نوع من الخلايا. في الخلايا غير المصابة، IRF3 تتعايش كأنواع غير فسفرته وhypophosphorylated تحتوي على phosphoresidues، بما في ذلك Thr135 وSer173، في 1 -198 أأ-N محطة المنطقة 6،12-14. تراكم هذا و hypophosphorylatedهو فعل مكتب إدارة السجلات من IRF3 بواسطة محرضات الإجهاد، وعوامل النمو وعوامل الإضرار DNA 6. الفسفرة من بقايا سر / منتدى المجالس الرومانسية في المنطقة C من محطة IRF3 تحتوي على المجال transactivation يتم تشغيل يتابع تفعيل الفيروسات، بولي I: C أو LPS في نوع الخلية بطريقة تعتمد 15-17. الفسفرة-C النهائي للIRF3 تشمل ما لا يقل عن 7 مواقع phosphoacceptor متميزة نظمت في مجموعتين رئيسيتين، Ser385 / Ser386 وSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405، التي تساهم كل لتفعيل IRF3 من خلال dimerization، تراكم النووي، بالتعاون مع CREB -binding البروتين (CBP) / coactivators P300، DNA ملزمة لالإنترفيرون عنصر استجابة حساسة (ISRE) تسلسل التوافق وtransactivation من الجينات المستهدفة 9،10،17-19. ويعتقد الفسفرة Thr390 أيضا للمساهمة في يسببها فيروس تفعيل IRF3 20. تحليل الطيف الكتلي من IRF3 أثبتت أن Ser386، Thr390، Ser396 وSer402 البقايا مباشرة phosphorylatإد من قبل المانع من كيلوبايت كيناز ε (IKKε) / ملزم TANK كيناز 1 (TBK1) تحركات 9،10. مطلوب أيضا الفسفرة في بقايا-C محطة لإنهاء تفعيل IRF3 من خلال polyubiquitination وبوساطة proteasome وتدهور 10. هذه العملية هي أيضا تعتمد على الفسفرة في Ser339، وهو أمر ضروري لتوظيف مزامرة بروبيل PIN1 10،11. وتعتبر الأنواع IRF3 التي تحتوي على ما لا يقل عن الفوسفات-Ser339 / 386/396 بقايا أشكال hyperphosphorylated. يبقى التسلسل الدقيق ووظيفة كل موقع مسألة مناقشة 10،21. فمن الواضح الآن أن IRF3 تنشيط لا يمثل دولة متجانسة، إلا أن الأنواع المختلفة تنشيط اظهار الفسفرة أو dimerization خصائص متميزة موجودة 10،22.لتوفير فهم كامل لتفعيل IRF3 ردا على مسببات الأمراض المحددة، بالتالي فمن الضروري لصفلاaracterize أي من الأنواع تفعيلها والتي يسببها. تحريض الجينات المستهدفة IRF3، IFNB1 وIFIT1، وقد ثبت أن نقدم موثوق للقراءة من أجل تفعيل IRF3. ومع ذلك، ورصد التعبير عن هذه الجينات لا يميز بين الدول التنشيط مختلفة من IRF3. يعتمد تحليل شامل للدول تفعيل IRF3 في وضع معين على توصيف مفصل للالفسفرة وdimerization ضعها 10. Unphosphorylated (النموذج الأول)، hypophosphorylated (النموذج الثاني) وhyperphosphorylated (أشكال الثالث والرابع) أشكال IRF3 6،18،23 يمكن حلها بنجاح من قبل قلة الحركة في قرار عالية من تحليل SDS-PAGE. الأنواع IRF3 أحادى ومثنوي يمكن تحديد كفاءة من خلال تحليل الأم-PAGE. يتم تحسين هذه المناهج إلى حد كبير عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة الموجهة ضد phosphospecific متميزة المواقع IRF3 phosphoacceptor.
بروتوكولات موحدة تسمح قرار فقيرالبروتينات التي لا يسمح الفصل الفعال للIRF3 متميزة أشكال فسفرته. هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء لتحقيق أعلى دقة لرصد تحريض متميزة الأنواع IRF3 تنشيط الفيروس باستخدام SDS-PAGE بالإضافة إلى الأم-PAGE في تركيبة مع طخة مناعية باستخدام الكلية وphosphospecific الأجسام المضادة. المجراة التمييز بين مختلف تفعيلها يتم تنفيذ أشكال IRF3 على أساس التحولات حراكها لوحظ على SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، IRF3 مونومر وديمر يمكن تمييزها من قبل الكهربائي غير تغيير طبيعة. الجمع بين هذه التقنيات التكميلية مع اثنين من طخة مناعية يبرهن على أن تكون نهجا بأسعار معقولة وحساسة للحصول على جميع المعلومات اللازمة لإجراء تحليل كامل لتفعيل بوساطة الفسفرة IRF3.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول وصفنا هنا يتكون من مزيج من عالية الدقة SDS-PAGE والأم-PAGE بالإضافة إلى استخدام العديد من الأجسام المضادة phosphospecific لتمييز أحادى / مثنوي وphosphoforms I-IV من IRF3. كشف المناسب من هذه الأنواع IRF3 ضروري لتوصيف كامل تفعيل IRF3 في وضع معين. على سبيل المثال، LPS تحفيز الضامة تفعيلها…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
- Juang, Y. T. et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., & Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N. et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., & Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., & Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J. et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y. et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K. et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M. et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F. et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T. et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G. et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., & Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B. et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M. et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A. et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., & Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996, (1998).
- Yoneyama, M. et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J. et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B. et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K. et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., & Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., & O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S. et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H. et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 248-254, (1976).
- Iwamura, T. et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388. (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., & Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A. et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N. et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
