Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
De alomtegenwoordig en constitutief uitgedrukt transcriptiefactor Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) is van cruciaal belang voor de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen voornamelijk door de inductie van IFNβ, maar ook door de inductie van de chemokine (CC-motief) ligand 5 (CCL5 ) en verscheidene antivirale eiwitten zoals IFN geïnduceerde eiwitten met tetratricopeptide herhaalt IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activering werd gemeld na infectie met verschillende virussen, of blootstelling aan polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) of lipopolysaccharide (LPS) 4. Belangrijker is, hebben de meeste bestudeerde virussen mechanismen ontwikkeld om de IRF3 gemedieerde respons te omzeilen, en daardoor ontsnappen aan de gastheer aangeboren afweer 5. Zo bewaken IRF3 activatie van groot belang te begrijpen van de moleculaire mechanismen van het aangeboren antivirale afweer, maar ook voor de door deze virussen reactie tegen strategie identificeren.
ent "> Veel gepubliceerde rapporten geven echter slechts een beperkte analyse van IRF3 activatie uitgevoerd door het volgen van IRF3-doelgen inductie (IFNB1 en IFIT1) en / of luciferase reportergen assay gekoppeld met lage resolutie natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS- PAGE) analyse van IRF3. evenwel talrijke biochemische studies, analyse van het gedrag van verschillende IRF3 mutanten en opheldering van IRF3 kristalstructuur 6-11 hebben bijgedragen IRF3 vast is onderworpen aan een complexe reeks opeenvolgende posttranslationele modificaties door fosforylatie bij meerdere plaatsen. De set van fosforylatie betrokken IRF3 activering wordt afhankelijk van de stimulus en hoogstwaarschijnlijk het celtype zijn. In niet-geïnfecteerde cellen, IRF3 coëxisteert als niet-gefosforyleerde en gehypofosforyleerde bevattende soorten phosphoresidues, waaronder Thr135 en Ser173, de 1 -198 aa N-terminale gebied 6,12-14. Ophoping van deze gehypofosforyleerde form van IRF3 wordt geïnduceerd door stress inducers, groeifactoren en DNA-beschadigende middelen 6. Fosforylering van Ser / Thr residuen aan het C-terminale gebied van IRF3 met het transactiveringsdomein wordt geactiveerd na activering door virussen, poly I: C of LPS in een celtype afhankelijke wijze 15-17. C-terminale fosforylering van IRF3 impliceert niet minder dan 7 verschillende phosphoacceptor locaties georganiseerd in twee clusters, Ser385 / Ser386 en Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, die elk bijdragen aan IRF3 activering door middel van dimerisatie, nucleaire accumulatie, associatie met het CREB -bindende eiwit (CBP) / p300 coactivatoren, DNA-bindende gevoelige respons element (ISRE) consensus sequenties en transactivatie van target genen 9,10,17-19 IFN. Fosforylering van Thr390 is ook gedacht om bij te dragen aan-virus-geïnduceerde IRF3 activering 20. Massaspectrometrie analyses van IRF3 hebben aangetoond dat Ser386, Thr390, Ser396 en Ser402 resten direct fosforylatieed door de remmer van KB-kinase ε (IKKε) /-TANK bindend kinase 1 (TBK1) kinasen 9,10. Fosforylering van het C-eindstandige resten is ook vereist voor beëindiging van IRF3 activering door middel polyubiquitinatie en proteasoom-afhankelijke afbraak 10. Deze werkwijze is ook afhankelijk van de fosforylatie van Ser339, die nodig is voor het aantrekken van de propyl isomerase Pin1 10,11. IRF3 species met tenminste fosfo-Ser339 / 386/396 residu's worden beschouwd gehyperfosforyleerd vormen. De exacte volgorde en de functie van elke site blijft een onderwerp van discussie 10,21. Het is nu duidelijk dat geactiveerd IRF3 vormt geen homogene staat, maar dat de verschillende geactiveerde soorten vertonen duidelijke fosforylering of dimerisatie kenmerken bestaan 10,22.Om een volledig begrip van IRF3 activering mogelijk in antwoord op specifieke pathogenen, is het dus noodzakelijk om characterize welke de geactiveerde species worden opgewekt. Inductie van IRF3 target genen, IFNB1 en IFIT1, heeft zich bewezen als een betrouwbare uitlezing voor IRF3 activering mogelijk maken. De controle expressie van deze genen geen onderscheid maakt tussen verschillende toestanden van activering IRF3. Een uitgebreide analyse van IRF3 activering staten in een bepaalde instelling is gebaseerd op de gedetailleerde karakterisering van de fosforylering en dimerisatie-status 10. Gefosforyleerde (formulier I), gehypofosforyleerde (vorm II) en hypergefosforyleerde (vormen III en IV) IRF3 vormen 6,18,23 succes kan worden opgelost door een verminderde mobiliteit in hoge-resolutie SDS-PAGE analyse. Monomeer en dimeer IRF3 soorten kunnen efficiënt worden geïdentificeerd door native-PAGE analyse. Deze benaderingen zijn sterk verbeterd bij gebruik in combinatie met fosfospecifiek antilichamen gericht tegen verschillende IRF3 phosphoacceptor sites.
Standaardprotocollen maken een slechte resolutie vaneiwitten die efficiënte scheiding van verschillende IRF3 gefosforyleerde vormen niet toestaat. Hier hebben we in vivo onderscheid tussen de verschillende geactiveerd in detail beschrijven een procedure om de hoogste resolutie bereiken de inductie van afzonderlijke-virus geactiveerd IRF3 soort, volgens SDS-PAGE gekoppeld met natieve PAGE in combinatie met immunoblot gebruikt totaal fosfospecifiek antilichamen te controleren. vormen van IRF3 wordt uitgevoerd op basis van hun mobiliteit verschuivingen waargenomen op SDS-PAGE. Bovendien kan IRF3 monomeer en dimeer worden onderscheiden door niet-denaturerende elektroforese. De combinatie van deze twee complementaire technieken met immunoblot blijkt een betaalbare en gevoelige benadering van alle nodige informatie voor een volledige analyse van fosforylering gemedieerde activering van IRF3 verwerven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschrijven we hier bestaat uit een combinatie van hoge-resolutie SDS-PAGE en natieve PAGE gekoppeld aan het gebruik van verschillende fosfospecifiek antilichamen tegen het monomeer / dimeer en phosphoforms I-IV van IRF3 onderscheiden. Geschikte detectie van deze IRF3 soort is essentieel om volledig te karakteriseren IRF3 activering in een specifieke instelling. Bijvoorbeeld, LPS stimulatie van geactiveerde macrofagen leidt tot de vorming van dimere, Ser396 / 398 gefosforyleerd IRF3 een gehypofosforyleerde …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
- Juang, Y. T. et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., & Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N. et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., & Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., & Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J. et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y. et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K. et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M. et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F. et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T. et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G. et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., & Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B. et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M. et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A. et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., & Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996, (1998).
- Yoneyama, M. et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J. et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B. et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K. et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., & Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., & O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S. et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H. et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 248-254, (1976).
- Iwamura, T. et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388. (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., & Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A. et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N. et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
