רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
גורם השעתוק הביע כל מקום בגוף וconstitutively אינטרפרון פקטור תקינה 3 (IFN) (IRF3) הוא קריטי עבור קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות הגיוס של IFNβ, אלא גם באמצעות הגיוס של chemokine (מוטיב CC) יגנד 5 (CCL5 ) וכמה חלבונים אנטי כוללים חלבון הנוצר על-IFN עם tetratricopeptide חוזר IFIT1 / 2/3 1-3. הפעלת IRF3 דווחה הזיהום הבא עם וירוסים רבים, או חשיפה לחומצת polyinosinic-polycytidylic (פולי אני: C) או lipopolysaccharide (LPS) 4. חשוב לציין, הווירוסים הנחקרים ביותר התפתחו מנגנונים להתחמק התגובה בתיווך IRF3, ובכך להימלט מארח ההגנה חיסונית מולדת 5. לפיכך, ניטור הפעלת IRF3 הוא בעל חשיבות רבה להבנת המנגנונים המולקולריים של ההגנה אנטי המארח המולדת, אלא גם לזהות את האסטרטגיה בשימוש על ידי וירוסים כדי לנטרל את התגובה הזאת.
אף אוזן גרון "> דיווחים שפורסמו רבים זאת לספק ניתוח מוגבל של הפעלת IRF3 מבוצעת על ידי הניטור של אינדוקציה גן IRF3-היעד (IFNB1 וIFIT1) ו / או assay גן הכתב בלוציפראז מצמידים ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ברזולוציה נמוך (SDS- עמוד) ניתוח של IRF3. עם זאת, מחקרים ביוכימיים רבים, ניתוח של ההתנהגות של מוטציות IRF3 שונות והבהרה של מבנה הגבישי IRF3 6-11 תרמו להקמת IRF3 שהוא נתון למערכת מורכבת של שינויים לאחר translational רציפים על ידי זרחון ב אתרים מרובים. הקבוצה של זירחון המעורב בהפעלת IRF3 מופיע להיות תלוי בגירוי וסביר להניח בסוג התא. בתאים נגוע, IRF3 מתקיים כמינים לא-פוספורילציה וhypophosphorylated מכילים phosphoresidues, כולל Thr135 וSer173, ב1 אזור -198 aa N-מסוף 6,12-14. הצטברות של f hypophosphorylated זהORM של IRF3 מושרה על ידי מעוררי מתח, גורמי גדילה וסוכנים הפוגע ב- DNA 6. זירחון של שאריות Ser / Thr באזור C-terminal של IRF3 מכיל תחום transactivation מופעל לאחר הפעלה על ידי וירוסים, פולי אני: C או LPS בתא מסוג אופן תלוי 15-17. זירחון C-מסוף של IRF3 כרוך לא פחות מ -7 אתרי phosphoacceptor שונים מאורגנים בשני אשכולות עיקריים, Ser385 / Ser386 וSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, שכל אחד יתרום להפעלת IRF3 דרך dimerization, הצטברות גרעינית, בשיתוף עם CREB חלבון -binding (CBP) / coactivators P300, DNA מחייב IFN אלמנט תגובה רגיש (ISRE) רצפי קונסנסוס וtransactivation של גני המטרה 9,10,17-19. זירחון של Thr390 הוא חשב גם לתרום להפעלת IRF3 המושרית-וירוס 20. ספקטרומטר מסת מנתח של IRF3 הוכיח כי שאריות Ser386, Thr390, Ser396 וSer402 ישירות phosphorylatאד על ידי מעכבי קינאז של ε κB (IKKε) / קינאז מחייב טנקי 1 (TBK1) קינאז 9,10. זירחון בשאריות C-המסוף נדרש גם להפסקת הפעלת IRF3 דרך polyubiquitination והשפלה בתיווך פרוטאזום 10. תהליך זה תלוי גם בזירחון בSer339, אשר הכרחי לגיוס של isomerase propyl PIN1 10,11. מיני IRF3 מכילים לפחות phospho-Ser339 / 386/396 שאריות נחשבים צורות hyperphosphorylated. הרצף והתפקוד המדויק של כל אתר נשאר עניין של דיון 10,21. עכשיו זה ברור שIRF3 הופעל אינו מייצג מדינה הומוגנית, אבל שמינים שונים מופעלים מציגים מאפייני זרחון או dimerization שונים קיימים 10,22.כדי לספק הבנה של הפעלת IRF3 שלמה בתגובה לפתוגנים ספציפיים, זה כך צורך CHaracterize שמהמינים מופעלים מושרים. אינדוקציה של גני מטרת IRF3, IFNB1 וIFIT1, הוכיחה לספק קריאה מתוך אמינה להפעלת IRF3. עם זאת, ניטור ביטוי של גנים אלה אינם מבחינים בין מדינות הפעלה השונות של IRF3. ניתוח מקיף של מדינות הפעלת IRF3 בהגדרה מסוימת מסתמך על האפיון מפורט של זירחון וdimerization מעמדו 10. Unphosphorylated (אני צורה), hypophosphorylated (טופס השני) וhyperphosphorylated (צורות III ו- IV) צורות IRF3 6,18,23 ניתן לפתור בהצלחה על ידי ניידות מופחתת בניתוח SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה. מיני IRF3 monomeric וdimeric ניתן לזהות ביעילות על ידי ניתוח ילידים-עמוד. גישות אלה השתפרו מאוד כאשר משתמשים בשילוב עם נוגדני phosphospecific המכוונים נגד אתרי phosphoacceptor IRF3 מובחנים.
פרוטוקולים סטנדרטיים מאפשרים רזולוציה נמוכה שלחלבונים שאינו מאפשרים הפרדה יעילה של צורות phosphorylated IRF3 המובחנת. כאן, אנו מתארים בפירוט הליך כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לפקח על הגיוס של מיני IRF3 שונים המופעל באמצעות וירוס SDS-PAGE מצמידים את ילידים-עמוד בשילוב עם immunoblot באמצעות נוגדנים כולל וphosphospecific. אפליה בvivo בין שונה מופעל צורות של IRF3 מתבצעת על בסיס משמרות הניידות שלהם נצפו על SDS-PAGE. בנוסף, מונומר IRF3 ודימר ניתן להבחין על ידי אלקטרופורזה denaturing שאינו. השילוב של שתי טכניקות משלימות אלה עם immunoblot מוכיח להיות גישה סביר ורגישה לרכוש את כל המידע הדרוש לניתוח של הפעלה בתיווך זירחון של IRF3 מלא.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול אנו מתארים כאן מורכב משילוב של רזולוציה גבוהה SDS-PAGE וילידים-עמוד מצמידים את השימוש של כמה נוגדני phosphospecific להבחין I-IV monomeric / dimeric וphosphoforms של IRF3. גילוי נאות של מיני IRF3 אלה הוא חיוני לאפיון הפעלת IRF3 באופן מלא בהגדרה ספציפית. לדוגמא, גירוי LPS של מקרופאגים מופעלים מ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
- Juang, Y. T. et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., & Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N. et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., & Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., & Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J. et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y. et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K. et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M. et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F. et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T. et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G. et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., & Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B. et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M. et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A. et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., & Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996, (1998).
- Yoneyama, M. et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J. et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B. et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K. et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., & Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., & O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S. et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H. et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 248-254, (1976).
- Iwamura, T. et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388. (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., & Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A. et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N. et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
