Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
O factor de transcrição ubíqua e constitutivamente expresso interferão (IFN) factor regulador 3 (IRF3) é crítica para a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, principalmente, através da indução de IFNp, mas também através da indução da quimioquina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e várias proteínas anti-virais, incluindo a proteína induzida por IFN com tetratricopeptide repete IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activação tem sido relatada após infecção com numerosos vírus, ou a exposição ao ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou lipopolissacárido (LPS) 4. É importante ressaltar que os vírus mais estudados desenvolveram mecanismos para fugir da resposta mediada por IRF3, e, assim, escapar o anfitrião defesa imune inata 5. Assim, a monitorização IRF3 activação é de grande importância para compreender os mecanismos moleculares da defesa do hospedeiro antiviral inata, mas também para identificar a estratégia utilizada pelo vírus para neutralizar esta resposta.
ENT "> Muitos relatórios publicados no entanto proporcionar apenas uma limitada análise de activação IRF3 realizada pela monitorização da indução do gene IRF3-alvo (IFNB1 e IFIT1) e / ou ensaio de gene repórter da luciferase associada a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio de baixa resolução (SDS- PAGE) análise de IRF3. No entanto, numerosos estudos bioquímicos, a análise do comportamento de vários mutantes IRF3 e elucidação da estrutura cristalina IRF3 6-11 contribuíram para estabelecer IRF3 que é submetido a uma série complexa de modificações pós-traducionais sequenciais por fosforilação em múltiplos locais. O conjunto de fosforilação envolvida na activação IRF3 parece ser dependente do estímulo e provavelmente do tipo de célula. Em células não infectadas, IRF3 coexiste como as espécies não-fosforilados e hipofosforilado contendo phosphoresidues, incluindo Thr135 e Ser173, no 1 região N-terminal -198 aa 6,12-14. Acumulação deste f hipofosforiladoORM de IRF3 é induzida por indutores de stress, factores de crescimento e agentes que danificam o DNA 6. A fosforilação de resíduos de Ser / Thr na região C-terminal de IRF3 que contém o domínio de transactivação é accionado a seguir a activação por vírus, poli I: C ou LPS em um tipo de célula modo dependente 15-17. C-terminal fosforilação de IRF3 envolve nada menos do que 7 sites de phosphoacceptor distintos organizados em dois grupos principais, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada um contribuir para a ativação IRF3 através de dimerização, a acumulação nuclear, associação com o CREB liga�o ao proteína (CBP) / coactivators P300, a ligação ao IFN elemento de resposta sensível (ISRE) sequências de consenso e de transativação de genes alvo 9,10,17-19 DNA. Fosforilação de Thr390 também é pensado para contribuir para a ativação induzida por vírus IRF3 20. Análises de espectrometria de massa de IRF3 demonstraram que Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 resíduos são directamente phosphorylated pelo inibidor da quinase kB ε (IKKε) / vinculativo TANK quinase 1 (TBK1) quinases 9,10. A fosforilação nos resíduos C-terminal é também necessário para a terminação da activação através IRF3 polyubiquitination e degradação mediada por proteassoma 10. Este processo é também dependente da fosforilação em Ser339, que é necessário para o recrutamento de isomerase propil Pin1 10,11. IRF3 espécies que contêm, pelo menos, fosfo-Ser339 / 386/396 resíduos são considerados formas hiperfosforiladas. A seqüência exata ea função de cada local continua a ser um assunto de discussão 10,21. É agora claro que IRF3 activado não representa um estado homogêneo, mas que as espécies activadas diferentes que apresentem características de fosforilação ou dimerização distintas existir 10,22.Para fornecer uma compreensão completa da ativação IRF3 em resposta a patógenos específicos, é necessário, portanto, characterize qual das espécies activadas são induzidas. A indução de genes alvo, IRF3 IFNB1 e IFIT1, provou proporcionar uma leitura fiável para a activação IRF3. No entanto, o acompanhamento expressão destes genes não faz distinção entre diferentes estados de ativação de IRF3. Uma análise abrangente dos estados de ativação IRF3 em um ambiente particular, baseia-se na caracterização detalhada de sua fosforilação e dimerização estado 10. Não fosforilada (forma I), hipofosforilado (forma II) e (hiperfosforiladas formas III e IV) formas IRF3 6,18,23 pode ser resolvido com êxito por mobilidade reduzida em alta-resolução análise de SDS-PAGE. Espécies IRF3 monoméricos e diméricos podem ser eficientemente identificado por análise de PAGE nativa. Estas abordagens são grandemente melhoradas quando utilizada em combinação com anticorpos dirigidos contra fosfoespec�ico IRF3 phosphoacceptor locais distintos.
Protocolos padrão permitem que um pobre de resoluçãoproteínas que não permite uma separação eficiente de formas fosforiladas IRF3 distintas. Aqui, descrevemos detalhadamente um procedimento para obter a mais alta resolução para monitorar a indução de espécies distintas IRF3 ativado-vírus usando SDS-PAGE acoplado a nativo-PAGE em combinação com immunoblot utilizando anticorpos totais e fosfoespec�ico. In vivo discriminação entre os diferentes ativado formas de IRF3 é executada com base nos seus deslocamentos de mobilidade observadas em SDS-PAGE. Além disso, IRF3 monómero e dímero podem ser distinguidos por electroforese não desnaturantes. A combinação destas duas técnicas complementares com immunoblot revela-se uma abordagem acessível e sensível para adquirir todas as informações necessárias para uma análise completa da activação mediada por fosforilação de IRF3.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito consiste de uma combinação de alta-resolução de SDS-PAGE e PAGE nativa-acoplado com a utilização de vários anticorpos fosfoespec�ico para distinguir o monomérica / dimérica e phosphoforms I-IV da IRF3. Detecção adequado dessas espécies IRF3 é essencial para caracterizar completamente a ativação IRF3 em um ambiente específico. Por exemplo, estimulação por LPS de macrófagos activados, conduz à formação de dimérico, Ser396 / 398 IRF3 fosforilado que exibe uma hipofosfor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
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