Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Die Translationsmaschinerie, dh die Polysoms oder Polyribosom, ist eines der größten und komplexesten Cytoplasma – Maschinen in den Zellen. Polysomen, von Ribosomen gebildet, mRNAs, mehrere Proteine und nicht-kodierenden RNAs repräsentieren Plattformen integriert die translationale Kontrollen stattfinden. Während jedoch das Ribosom wurde weitgehend untersucht, die Organisation von Polysomen noch fehlt umfassendes Verständnis. So viel Aufwand ist erforderlich, um Polysoms Organisation und jede neuen Mechanismus der Translationskontrolle aufzuklären, die eingebettet werden können. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine Art von Rastersondenmikroskopie, welche die Erfassung von 3D-Bildern in nanoskaliger Auflösung ermöglicht. Im Vergleich zu der Elektronenmikroskopie (EM) Techniken, einer der wichtigsten Vorteile von AFM ist, dass es Tausende von Bildern sowohl in der Luft als auch in Lösung zu erwerben, so dass die Probe aufrecht erhalten werden unter nahezu physiologischen Bedingungen, ohne dass für die Färbung und Fixierung Proverfahren. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die genaue Reinigung von Polysomen aus Gehirn der Maus und ihre Abscheidung auf Glimmersubstraten beschrieben. Dieses Protokoll ermöglicht Polysomen-Bildgebung in Luft und Flüssigkeit mit AFM und deren Rekonstruktion dreidimensionaler Objekte. Ergänzend zur Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) kann das vorgeschlagene Verfahren günstig für die systematische Analyse Polysomen verwendet werden, und ihre Organisation zu studieren.
Introduction
Die Synthese von Protein ist der energieverbrauchenden Prozess in Zellen 1,2. Daher ist es nicht verwunderlich , dass Protein Abundanzen vor allem auf der Translations gesteuert werden , anstatt Transkriptionsebene 3,4,5. Die Polysoms ist die grundlegende Komponente, die die hochmolekularen mRNA Information in funktionelle proteinöse Ablesungen umwandelt. Polysomen werden so weit als makromolekulare Komplexe erkannt , wo mehrere Translations Kontrollen 13.06 konvergieren. Trotz Hunderten von Studien über die Ribosomenstruktur 14- 16, die detaillierte molekulare Einblicke in die Dynamik der Übersetzung und die Topologie von Polysomen hat ein begrenztes Interesse gestoßen. Als Folge davon sind die Organisation des nativen polysomaler Ribonukleoproteinkomplex und seine möglichen Auswirkungen auf die Übersetzung noch ziemlich unklar Fragen. Polysomen kann noch unbekannt bestellt und funktionale Organisationen verbergen, potenziell Spiegelung was Nukleosomen und epigenetische controls haben für die Transkription Feld dargestellt. Tatsächlich erfordert die Untersuchung dieser faszinierenden Hypothese zusätzliche Studien und neue technische Ansätze. In dieser Zeile können zusammenarbeiten , um Strukturtechniken und Rasterkraftmikroskopie fruchtbarer neue Mechanismen entwirren für die Genexpression steuern, ähnlich zu dem, was für die Nukleosomen 17,18 erreicht.
Seit der Entdeckung des Ribosoms 14-16 hat seine Struktur wurde in Prokaryoten 19,20, Hefe 21 und in jüngerer Zeit in der Human 22, die Bereitstellung der molekulare Beschreibung der Mechanismen an der Basis der Proteinsynthese umfassend charakterisiert. Polysomen wurden zunächst auf die Membran des endoplasmatischen Retikulums erkannt, typische 2D geometrische Organisationen 14 bilden. Wie bereits erwähnt, hat Polysoms Montage Gegenstand ständiger Interesse, wie die Ribosomenstruktur nicht gewesen. In der Vergangenheit Polysomen wurden im wesentlichen durch tr studiertansmission EM-basierte Techniken. Erst vor kurzem freigegeben Kryo-EM – Techniken , um die 3D – Rekonstruktion von gereinigtem Polysomen von de – vitro – Translationssysteme 23-26, menschliche Zellysaten 27 oder in den Zellen 28. Diese Techniken angeboten verfeinerte Information über das Ribosom-Ribosomen Organisation in Polysomen 23, 26-28 und eine vorläufige molekulare Beschreibung der Kontaktflächen benachbarter Ribosomen in Weizenkeim Polysomen 24. Somit ermöglicht Kryo-EM-Tomographie die Offenlegung von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen mit molekularen Detail, aber es ist durch umfangreiche Nachbearbeitung belastet und Rekonstruktion Analysen, erfordern schwere Rechenressourcen für die Datenverarbeitung. Darüber hinaus wird die molekulare Detail von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen, eine hochaufgelöste Karte des Ribosoms zu erhalten erforderlich, und diese Art von Referenz Ribosom ist nur für wenige Arten. Wichtig ist, dass Kryo-EM-Tomographie freie RNA nachzuweisen nicht in der Lage. d daherErz, werden neue Techniken benötigt, um vollständig die Organisation der Translationsmaschinerie zu verstehen.
Neben Kryo-EM wurde AFM auch als ein nützliches Werkzeug für die direkte Abbildung von Polysomen in niederen Eukaryoten 29-33 und Menschen 27 eingesetzt. Im Vergleich zu EM, erfordert AFM keine Probe Fixierung oder Kennzeichnung. Darüber hinaus können Messungen in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und mit der einzigartigen Möglichkeit , beide Ribosomen und nackter RNA – Stränge 27 eindeutig zu identifizieren. Abbildung einzelner Polysomen kann relativ schnell durchgeführt werden, Tausende von Bildern auf der nano-Auflösung mit wenig Nachbearbeitung Aufwand im Vergleich zu der umfangreichen und schweren Nachbearbeitung Erhalt und Wiederaufbau Analysen durch Kryo-EM-Mikroskopie erforderlich. Folglich stellt AFM Datenverarbeitung und Analyse nicht teuer Workstations benötigen und eine hohe Rechenleistung. Als solches sammelt sich diese Technik Informationen über polysomaler Formen, morphologischen Eigenschaften (wieHöhe, Länge und Breite), Ribosom Dichten, das Vorhandensein von freien RNA und die Anzahl der Ribosomen pro Polysomen 27 mit einem höheren Durchsatz als Kryo-EM. In einer solchen Weise stellt AFM eine leistungsfähige und komplementären Ansatz Techniken zur EM Polysomen zu porträtieren 27.
Hier präsentieren wir eine komplette Pipeline von der Reinigung bis zur Datenanalyse in dem AFM Bild angewendet wird und Mausgehirn Polysomen analysieren. Das vorgeschlagene Protokoll konzentriert sich auf die Reinigung Fragen und auf die genaue Ablagerung von Polysomen auf Glimmersubstraten, die für AFM-Bildgebung verwendet werden. Zusätzlich zu den herkömmlichen Partikelanalyse , die leicht mit gängigen Software ausgeführt werden können , von der AFM – Gemeinschaft verwendet wird , ein ImageJ 34 – Plugin, genannt RiboPick wird zum Zählen der Anzahl von Ribosomen pro Polysoms 27 präsentiert, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die Struktur der DNA bewiesen wurde von größter Bedeutung sein, den Prozess der Transkription und die Organisation von Chromatin voran unser Verständnis der Transkriptionskontrolle der Genexpression zu beschreiben, ist es wichtig, die Organisation und Struktur der Polysomen zu analysieren, um die wahrheitsgemäße Verständnis zu verbessern der Übersetzung und deren Regulierung.
Mit dem beschriebenen Protokoll wird eine optimale Dichte von Polysomen sanft auf eine flache Oberfläche i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
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