原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
翻訳機構は、 すなわち、ポリソームまたはポリリボソームは、細胞内で最大かつ最も複雑な細胞質機械の一つです。リボソーム、mRNAを、いくつかのタンパク質非コードRNAによって形成されたポリソームは、翻訳制御が行われるプラットフォームを統合表します。リボソームは、広く研究されているがしかし、ポリソームの組織はまだ包括的に理解を欠いています。このように多くの努力がポリソーム組織と埋め込まれていてもよい翻訳制御のいずれかの新たなメカニズムを解明するために必要とされます。原子間力顕微鏡（AFM）は、ナノスケールの解像度で3D画像の取得を可能にする走査型プローブ顕微鏡の一種です。電子顕微鏡（EM）の技術に比べて、AFMの主な利点の一つは、それが染色およびプロ固定を必要とせずに近くの生理学的条件下で維持されるべきサンプルを可能に空気中で、溶液中に両方の画像の数千を取得することができるということですcedures。ここでは、マウス脳及びマイカ基板上での堆積からポリソームの正確な精製のための詳細なプロトコールが記載されています。このプロトコルは、AFMと3次元物体としての復興と空気や液体中でポリソームイメージングを可能にします。低温電子顕微鏡（クライオEM）に相補的な、提案された方法は、好都合に系統的ポリソームを分析し、それらの組織を研究するために使用することができます。
Introduction
タンパク質の合成は、細胞1,2の中で最もエネルギーを消費するプロセスです。したがって、タンパク質の存在量は、主に翻訳なく転写レベル3,4,5で制御されることではない驚くべきことです。ポリソームは、機能的なタンパク質性の読み出しへのmRNAの情報を変換する基本的な高分子成分です。ポリソームは、これまでいくつかの翻訳のコントロールが6-13を収束高分子複合体として認識されています。リボソーム構造14〜16に関する研究の数百にもかかわらず、翻訳のダイナミクスへの詳細な分子洞察やポリソームのトポロジーは、限られた関心が発生しました。その結果、ネイティブポリソームリボ核タンパク質複合体の組織や翻訳に対する潜在的な効果はまだとても曖昧な問題です。ポリソームは、潜在的にどのようなヌクレオソームとエピジェネティック制御をミラーリング、まだ不明注文し、機能的な組織を非表示にすることができますlsコマンドは、転写フィールドに表されています。実際、この魅力的な仮説の調査は、さらなる研究と新しい技術的なアプローチが必要です。この行では、構造的な技術や原子間力顕微鏡は、実り同様にヌクレオソーム17,18のために達成されたものに、遺伝子発現を制御するための新しいメカニズムを解明するために協力することができます。
リボソーム14-16の発見以来、その構造は、広範囲のタンパク質合成のベースにメカニズムの分子の説明を提供する、原核生物19,20、より最近のヒト22における酵母21とで特徴付けられています。ポリソームは、最初は、一般的な2D幾何学的な組織14を形成し 、小胞体の膜に認められました。前に述べたように、ポリソームアセンブリは、リボソーム構造などの一定の関心の対象ではなかったです。過去には、ポリソームはTRによって、本質的に研究されてきましたansmission EMベースの技術。ごく最近になって、クライオEM技術は、人間の細胞溶解物27またはセル28で、23-26 インビトロ翻訳系から精製されたポリソームの3D再構成を可能にしました。これらの技術はポリソーム23、26-28と小麦胚芽ポリソーム24内の隣接するリボソームの接触面の予備的分子の説明ではリボソームリボソーム組織に関するより多くの洗練された情報を提供しました。したがって、クライオEM断層撮影法は、分子の詳細とリボソームリボソーム相互作用の開示を可能にするが、それはデータ処理のために重い計算リソースを必要とする大規模なポスト処理及び再構成の分析によって負担されます。また、リボソームリボソーム相互作用の分子の詳細を得るために、リボソームの高解像度のマップが必要とされ、基準リボソームのこの種のは、ほんの数種のために利用可能です。重要なことは、低温電子顕微鏡断層撮影法では、無料RNAを検出することができません。 Theref鉱石は、新しい技術が完全に翻訳機構の組織を理解する必要があります。
クライオEMのほかに、AFMはまた、下等真核生物29-33と人間27にポリソームの直接画像化のための有用なツールとして採用されています。 EMと比較すると、AFMには、サンプルの固定または標識化を必要としません。また、測定は、近くの生理学的条件下で、はっきりとリボソームと裸のRNA鎖27の両方を特定するユニークな可能性を用いて行うことができます。単一ポリソームのイメージングは、広範かつ重いポスト処理及び再構成に比べて少し後処理の労力でナノ分解能で数千ものイメージを取得し、比較的迅速に行うことができるクライオEM顕微鏡で必要とされる分析。その結果、AFMデータハンドリング及び分析は、高価なワークステーションと高い演算能力を必要としません。このように、この技術は、ポリソームの形状に関する情報を収集し、形態学的特性（例えば高さ、長さと幅）、リボソーム密度、自由なRNAの存在とクライオEMよりも高いスループットでポリソーム27あたりのリボソームの数。このように、AFMはポリソーム27を描写するためにEM技術に強力かつ補完的なアプローチを示します。
ここでは、AFMが画像に適用し、マウス脳ポリソームを分析されたデータの分析に精製からの完全なパイプラインを提示します。提案されたプロトコルは、精製の問題にとAFMイメージングのために使用されているマイカ基板上のポリソームの正確な堆積に焦点を当てています。簡単にAFMコミュニティで使用される一般的なソフトウェアを用いて行うことができる従来の粒子の分析に加えて、RiboPick呼ばImageJの34プラグインは、ポリソーム27、35当たりのリボソームの数をカウントするために提示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNAの構造は転写およびクロマチンの組織化は、遺伝子発現の転写制御の我々の理解を進めたようなプロセスを記述するために最も重要であることが証明されたように、真実の理解を向上させるためにポリソームの組織構造を分析することが不可欠です翻訳とその調節の。
記載されたプロトコルを用いて、穏やかに平坦な表面上に固定化されたポリソームの最適密度は、A…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
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