מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
מנגנון translational, כלומר, polysome או polyribosome, הוא אחת הכונה ציטופלסמית הגדולות והמורכבות ביותר בתאים. Polysomes, שהוקם על ידי הריבוזומים, mRNAs, כמה חלבוני RNAs ללא קידוד, מייצג פלטפורמות משולבות שבו שולט translational להתקיים. עם זאת, בעוד הריבוזום נחקר באופן נרחב, ארגון polysomes עדיין חסר הבנה מקיפה. כך מאמץ רב נדרש כדי להבהיר ארגון polysome וכל מנגנון חדשני מלא translational שעשוי להיות מוטבע. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא סוג של מיקרוסקופיה בדיקת סריקה המאפשר רכישת תמונות 3D ברזולוציה של ננו. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) טכניקות, אחד היתרונות העיקריים של AFM הוא שזה יכול לרכוש אלף תמונות הם אוויר בתמיסה, מה שמאפשר את המדגם כדי להישמר בתנאים פיסיולוגיים ליד ללא כל צורך מכתים ותיקון פרופרוצדורות. כאן, פרוטוקול מפורט לטיהור המדויקת של polysomes ממוח עכבר בתצהיר שלהם על מצעים יציצו מתואר. פרוטוקול זה מאפשר הדמית polysome באוויר ואת הנוזלים עם AFM והשחזור שלהם כמו אובייקטים תלת-ממדיים. משלימים במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- (cryo-EM), השיטה המוצעת ניתן להשתמש בנוחות לניתוח polysomes ולומדים הארגון שלהם באופן שיטתי.
Introduction
הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים 1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא 3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס 6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום 14- 16, תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום 17,18.
מאז גילויו של הריבוזום 14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים 19,20, שמרים 21 ולאחרונה ב -22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים 14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה 23-26, lysates הסלולר אדם 27 או בתאים 28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes 23, 26-28 ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה 24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום.
לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון 29-33 ובני אדם 27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום 27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome 27 עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes 27.
כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף 34 ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו מבנה ה- DNA הוכח להיות בעל חשיבות עליונה כדי לתאר את התהליך של שעתוק כארגון של הכרומטין קידם את ההבנה שלנו של שליטה תעתיק של ביטוי גנים, חשוב לנתח את הארגון והמבנה של polysomes לשפר הבנה אמת תרגום והרגולציה שלה.
עם הפרוטוקול המתואר, צ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochimie. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
