Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Le mécanisme de translation, à savoir le polysomes ou polyribosome, est l' un des plus grands et les plus complexes machineries cytoplasmiques dans les cellules. Polysomes, formés par les ribosomes, les ARNm, plusieurs protéines et les ARN non-codants, représentent les plates-formes où les contrôles ont lieu traductionnelles intégrés. Cependant, alors que le ribosome a été largement étudiée, l'organisation de polysomes fait encore défaut compréhension globale. beaucoup d'efforts sont donc nécessaires afin d'élucider l'organisation polysomes et tout nouveau mécanisme de contrôle de la traduction qui peut être intégré. La microscopie à force atomique (AFM) est un type de sonde à balayage microscopie qui permet l'acquisition d'images 3D à résolution nanométrique. Par rapport à la microscopie électronique (EM) techniques, l'un des principaux avantages de l'AFM est qu'il peut acquérir des milliers d'images à la fois dans l'air et en solution, ce qui permet de l'échantillon à être maintenu dans des conditions proches physiologiques sans qu'il soit nécessaire pour la coloration et la fixation procédures. Ici, un protocole détaillé pour la purification précise de polysomes de cerveau de souris et leur dépôt sur des substrats de mica est décrite. Ce protocole permet l'imagerie polysomes dans l'air et aux liquides avec l'AFM et leur reconstitution sous forme d'objets en trois dimensions. En complément de cryo-microscopie électronique (cryo-EM), la méthode proposée peut être commodément utilisé pour analyser systématiquement polysomes et l'étude de leur organisation.
Introduction
La synthèse des protéines est le processus consommant de l' énergie plus dans les cellules 1,2. Par conséquent, il est pas surprenant que les abondances de protéines sont principalement contrôlées à la translation plutôt que la transcription 3,4,5 niveau. Le polysomes est le composant macromoléculaire fondamental qui convertit les informations ARNm en lectures protéiniques fonctionnels. Polysomes sont jusqu'ici considérées comme des complexes macromoléculaires , où plusieurs commandes de translation convergeant 13/06. Malgré des centaines d'études sur la structure du ribosome 14- 16, les connaissances moléculaires détaillées sur la dynamique de la traduction et la topologie de polysomes a rencontré un intérêt limité. En conséquence, l'organisation du complexe polysomal ribonucléoprotéinique natif et son effet potentiel sur la traduction sont encore des questions plutôt obscures. Polysomes peuvent se cacher encore des organisations ordonnées et fonctionnelles inconnues, potentiellement en miroir ce que nucléosomes et contro épigénétiquels ont représenté pour le champ de transcription. En effet, l'enquête de cette hypothèse intrigante nécessite des études supplémentaires et de nouvelles approches techniques. Dans cette ligne, les techniques structurelles et microscopie à force atomique peuvent fructueusement collaborer pour percer de nouveaux mécanismes pour contrôler l' expression des gènes, de façon similaire à ce qui a été réalisé pour le nucléosome 17,18.
Depuis la découverte du ribosome 14-16, sa structure a été caractérisée en détail dans les procaryotes, les levures 19,20 21 et , plus récemment , chez l' homme 22, fournissant la description des mécanismes moléculaires à la base de la synthèse protéique. Polysomes ont été comptabilisés initialement sur la membrane du réticulum endoplasmique, formant des organisations géométriques 2D typiques 14. Comme mentionné précédemment, polysomes ensemble n'a pas fait l'objet d'un intérêt constant que la structure du ribosome. Dans le passé, les polysomes ont été étudiés essentiellement en transmission EM-fondé des techniques. Seulement récemment, des techniques de cryo-EM ont permis à la reconstruction 3D de polysomes purifiés à partir de systèmes de traduction in vitro 23-26, des lysats cellulaires humaines 27 ou 28 dans les cellules. Ces techniques offrent des informations plus fine sur l'organisation ribosome ribosomes dans les polysomes 23, 26-28 et la description moléculaire préalable des surfaces adjacentes de ribosomes dans les polysomes de germe de blé 24 de contact. Ainsi, cryo-EM tomographie permet la divulgation des interactions ribosomes ribosome avec détail moléculaire, mais il est grevé par une vaste post-traitement et analyse la reconstruction qui nécessitent des ressources informatiques lourds pour le traitement des données. De plus, pour obtenir le détail moléculaire des interactions ribosome-ribosome, une carte à haute résolution du ribosome est nécessaire, et ce genre de ribosome de référence est disponible seulement pour quelques espèces. Surtout, cryo-EM tomographie ne parvient pas à détecter l'ARN libre. Therefminerai, de nouvelles techniques sont nécessaires pour comprendre l'organisation de la machinerie de traduction.
A côté de cryo-EM, l' AFM a également été utilisé comme un outil utile pour l' imagerie directe de polysomes dans les eucaryotes inférieurs 29-33 et les humains 27. Par rapport à EM, l'AFM ne nécessite aucun échantillon de fixation ou de l'étiquetage. En outre, les mesures peuvent être effectuées dans des conditions physiologiques proches et avec la possibilité unique d'identifier clairement les ribosomes et les brins d'ARN nus 27. L'imagerie de polysomes simples peut être effectuée relativement rapidement, en obtenant des milliers d'images à nano-résolution avec peu d'effort post-traitement par rapport au post-traitement vaste et lourd et de reconstruction analyses requises par microscopie cryo-EM. Par conséquent, l'AFM de la manipulation et l'analyse des données n'a pas besoin de postes de travail coûteux et grande puissance de calcul. En tant que telle, cette technique recueille des informations sur la forme des polysomal, les caractéristiques morphologiques (par exemple,hauteur, longueur et largeur), les densités ribosome, la présence d'ARN libre et le nombre de ribosomes par polysomes 27 avec un débit plus élevé que cryo-EM. De telle manière, AFM représente une approche puissante et complémentaire aux techniques EM pour représenter polysomes 27.
Nous présentons ici un pipeline complet de la purification à l'analyse de données où AFM est appliqué à l'image et l'analyse polysomes du cerveau de souris. Le protocole proposé se concentre sur les problèmes de purification et le dépôt précis de polysomes sur des substrats de mica qui sont utilisés pour l'imagerie AFM. En plus de l' analyse des particules classiques qui peuvent être facilement réalisée avec un logiciel commun utilisé par la communauté de l' AFM, un plugin ImageJ 34, appelé RiboPick, est présenté pour compter le nombre de ribosomes par polysomes 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme la structure de l'ADN a été prouvé être d'une importance capitale pour décrire le processus de transcription et que l'organisation de la chromatine a avancé notre compréhension du contrôle transcriptionnel de l'expression génique, il est essentiel d'analyser l'organisation et la structure des polysomes pour améliorer la compréhension véridique de la traduction et de son règlement.
Avec le protocole décrit, une densité optimale de polysomes douceme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochimie. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
