Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l'organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l'acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l'imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.
Introduction
La sintesi delle proteine è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l'organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l'indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell'espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma 17,18.
Dalla scoperta del ribosoma 14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti 19,20, lievito 21 e più recentemente in umano 22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici 14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione 23-26, lisati cellulari umani 27 o 28 nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull'organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi 23, 26-28 e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano 24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l'RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l'organizzazione della macchina di traduzione.
Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l'imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori 29-33 e gli esseri umani 27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l'etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi 27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l'analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome 27 con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi 27.
Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l'analisi dei dati in cui AFM viene applicata all'immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l'imaging AFM. Oltre all'analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ 34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l'organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell'espressione genica, è essenziale analizzare l'organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione.
Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizza…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
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