Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии
Summary
While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Abstract
Поступательное машины, т.е. полисом или polyribosome, является одним из самых больших и самых сложных механизмов в цитоплазме клеток. Полисомы, образованные рибосом, мРНК, несколько белков и некодирующих РНК, представляют собой интегрированные платформы, на которых трансляционные элементы управления имеют место. Тем не менее, в то время как рибосома широко изучается, организация полисом до сих пор отсутствует полное понимание. Так много усилий требуется для того, чтобы выяснить полисом организации и любой новый механизм трансляционной управления, который может быть встроен. Атомно-силовой микроскопии (AFM) представляет собой тип сканирующей зондовой микроскопии, который позволяет приобретение 3D-изображений с разрешением наноуровне. По сравнению с методами электронной микроскопии (ЭМ), одним из главных преимуществ AFM является то, что он может получить тысячи изображений, как в воздухе, так и в растворе, что позволяет образца, который должен поддерживаться в условиях, близких физиологических условиях, без какой-либо необходимости для окрашивания и фиксации процедуры. Здесь подробный протокол для точной очистки полисом от мышиного мозга и их осаждении на слюде подложках описан. Этот протокол позволяет полисом визуализации в воздухе и жидкости с AFM и их реконструкции в виде трехмерных объектов. В дополнение к крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), предложенный метод может быть легко использован для систематического анализа полисом и изучения их организации.
Introduction
Синтез белка является наиболее энергоемким процессом в клетках 1,2. Следовательно, не удивительно , что белковые содержаний в основном контролируются на поступательными , а не транскрипционной 3,4,5 уровня. Полисом является фундаментальным макромолекулярная компонентом, который преобразует информацию мРНК в функциональных белковыми считываниями. Полисомы до сих пор признается в качестве макромолекулярных комплексов , где несколько поступательных управления сходящихся 6-13. Несмотря на сотни исследований структуры рибосом 14- 16, детальные молекулярные способность проникновения в суть динамики перевода и топология полисом обнаружена ограниченный интерес. Как следствие, организация родного polysomal рибонуклеопротеиновой комплекса и его потенциальное влияние на перевод все еще довольно неясными вопросы. Полисомы может скрыть все еще неизвестные налаженной и функциональной организации, потенциально отражая какие нуклеосом и эпигенетические ControLs представляли для поля транскрипции. Действительно, исследование этой интригующей гипотезы требует дополнительных исследований и новых технических подходов. В этой линии, структурные методы и атомно – силовой микроскопии могут плодотворно сотрудничать , чтобы раскрыть новые механизмы для контроля экспрессии генов, аналогично тому , что было достигнуто за нуклеосомой 17,18.
С момента открытия рибосомы 14-16, его структура была широко охарактеризованы в прокариот, дрожжей 19,20 21 и совсем недавно в человеческом 22, обеспечивая молекулярное описание механизмов на основе синтеза белка. Полисомы были первоначально признаны на мембране эндоплазматической сети, образуя типичные 2D геометрические организации 14. Как упоминалось ранее, полисом сборка не является объектом постоянного интереса как структуры рибосом. В прошлом полисома были изучены по существу Тгansmission ЭМ на основе методов. Только в последнее время , методы крио-ЭМ позволило 3D – реконструкция очищенных полисом из систем 23-26 перевода в пробирке, клеточные лизаты человека 27 или в клетках 28. Эти методы предложили более рафинированный информацию о рибосом-рибосома организации в полисом 23, 26-28 и предварительный молекулярный описание контактных поверхностей соседних рибосом зародышей пшеницы в полисом 24. Таким образом, крио-ЭМ томография позволяет раскрытие рибосом-рибосома взаимодействий с молекулярной подробно, но она обременена обширной постобработки и реконструкции аналитических исследований, которые требуют больших вычислительных ресурсов для обработки данных. Кроме того, чтобы получить молекулярную деталь рибосом-рибосома взаимодействий, весьма разрешены карту рибосомы требуется, и этот вид опорной рибосомы доступен только для нескольких видов. Важно отметить, что крио-ЭМ томография не в состоянии обнаружить свободную РНК. Therefруда, новые методы, необходимые для полного понимания организации перевода машин.
Помимо крио-ЭМ, AFM был также использован в качестве полезного инструмента для непосредственного получения изображений полисом в низших эукариот 29-33 и человека 27. По сравнению с ЭМ, AFM не требует фиксации образца или маркировки. Кроме того, измерения могут быть выполнены в почти физиологических условиях и с уникальной возможностью четко идентифицировать как рибосомы и обнаженные нити РНК 27. Визуализация отдельных полисом может быть выполнена относительно быстро, получая тысячи изображений на нано-разрешением с небольшим усилием постобработки по сравнению с обширной и тяжелой последующей обработки и анализа реконструкции требуется крио-ЭМ микроскопии. Следовательно, AFM обработки и анализа данных не нужны дорогостоящие рабочие станции и высокой вычислительной мощности. Таким образом, этот метод собирает информацию о polysomal формы, морфологические характеристики (например,высота, длина и ширина), рибосома плотности, наличие свободной РНК и число рибосом на полисом 27 с более высокой пропускной способности, чем крио-ЭМ. Таким образом, AFM представляет собой мощный и комплементарный подход к методам EM изобразить полисом 27.
Здесь мы представляем полный трубопровод от очистки к анализу данных, где AFM применяется к изображению и анализа мыши полисом мозга. Предлагаемый протокол сосредоточен на вопросах очистки и на точном осаждения полисом на слюде субстратов, которые используются для создания изображений АФМ. В дополнение к обычным анализа размеров частиц , которые могут быть легко выполнены с общим программным обеспечением , используемой AFM общности, ImageJ 34 плагин, называемый RiboPick, представлен для подсчета количества рибосом на полисом 27, 35.
Protocol
Representative Results
Discussion
По мере того как структура ДНК была доказана, чтобы иметь первостепенное значение для описания процесса транскрипции и как организация хроматина продвинули наше понимание транскрипционный контроль экспрессии генов, необходимо проанализировать организацию и структуру полисом, чтоб?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Materials
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochimie. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
