Peering på Brain Polysomer med Atomic force mikroskopi

Summary

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Abstract

Den translationelle maskiner, dvs polysom ​​eller polyribosome, er en af de største og mest komplekse cytoplasmatiske machineries i celler. Polysomer, der dannes ved ribosomer, mRNA'er, flere proteiner og ikke-kodende RNA'er, repræsenterer integrerede platforme, hvor translationelle kontrol finder sted. Men mens ribosomet er blevet bredt studeret, afholdelse af polysomer mangler stadig omfattende forståelse. Således kræves en stor indsats for at belyse polysom ​​organisation og enhver ny mekanisme for translationel kontrol, som kan indlejres. Atomic force mikroskopi (AFM) er en type af scanning probe mikroskopi, der tillader køb af 3D-billeder på nanoskala opløsning. Sammenlignet med elektronmikroskopi (EM) teknikker, en af ​​de vigtigste fordele ved AFM er, at det kan erhverve tusindvis af billeder både i luften og i opløsning, således at prøven, der skal holdes under nær fysiologiske betingelser uden behov for farvning og fastsættelse proprocedurer. Her er en detaljeret protokol til nøjagtig rensning af polysomer fra musehjerne og deres afsætning på glimmer substrater beskrevet. Denne protokol muliggør polysom ​​billeddannelse i luft og væske med AFM og deres rekonstruktion som tredimensionale genstande. Supplerende til cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), kan den foreslåede metode bekvemt bruges til systematisk at analysere polysomer og studere deres organisation.

Introduction

Syntesen af protein er den mest energikrævende proces i celler ^1,2. Derfor er det ikke overraskende, at protein mængderne hovedsagelig styres på translatoriske i stedet for transkriptionel niveau ^3,4,5. Polysom ​​er den grundlæggende makromolekylære komponent, der konverterer mRNA oplysninger i funktionelle proteinholdige udlæsninger. Polysomer er hidtil anerkendt som makromolekylære komplekser, hvor flere translationelle kontroller konvergerer ^6-13. Trods hundredvis af undersøgelser af ribosom struktur ^{14- 16,} er de detaljerede molekylære indsigt i dynamikken i oversættelse og topologi polysomer stødt på en begrænset interesse. Som en konsekvens, organiseringen af ​​den indfødte polysomalt ribonukleoproteinkompleks og dens potentielle effekt på oversættelse er stadig temmelig obskure spørgsmål. Polysomer kan skjule stadig ukendt bestilt og funktionelle organisationer, potentielt spejling hvilke nukleosomer og epigenetiske controls har repræsenteret for transskription feltet. Faktisk undersøgelsen af ​​denne spændende hypotese kræver yderligere undersøgelser og nye tekniske tilgange. I denne linje, kan strukturelle teknikker og atomic force mikroskopi frugtbart samarbejde om at opklare nye mekanismer til styring af genekspression, hvilket svarer til resultaterne opnået for nukleosom ^17,18.

Siden opdagelsen af ribosomet ^14-16, er dens struktur blevet grundigt karakteriseret i prokaryoter ^19,20, gær ²¹ og senere i human ^22, hvilket giver den molekylære beskrivelse af mekanismerne ved basis af proteinsyntese. Polysomer blev oprindeligt indregnet på membranen af det endoplasmatiske reticulum, danner typiske 2D geometriske organisationer ^14. Som nævnt før, er polysom ​​samling ikke været genstand for konstant interesse som ribosomet struktur. I fortiden, er polysomer væsentlige blevet undersøgt af transmission EM-baserede teknikker. Først for nylig, cryo-EM teknikker aktiveret 3D-rekonstruktion af oprensede polysomer fra in vitro-oversættelse systemer ^23-26, menneskelige cellelysater ²⁷ eller i celler ^28. Disse teknikker tilbudt mere raffineret oplysninger om ribosomet-ribosom organisation i polysomer ^{23, 26-28} og en foreløbig molekylær beskrivelse af kontaktfladerne af tilstødende ribosomer i hvedekim polysomer ^24. , Cryo-EM tomografi tillader således offentliggørelse af ribosom-ribosom interaktioner med molekylær detalje, men det er tynget af en omfattende efterbehandling og genopbygning analyser, som kræver tunge it-ressourcer til datahåndtering. Desuden at opnå den molekylære detaljer af ribosom-ribosom interaktioner, er en højt løst kort over ribosomet påkrævet, og denne form for henvisning ribosom er kun tilgængelig for nogle få arter. Vigtigere, cryo-EM tomografi er ikke i stand til at påvise frit RNA. Therefmalm, er nye teknikker forpligtet til fuldt ud at forstå organiseringen af ​​oversættelsen maskiner.

Udover cryo-EM har AFM også blevet ansat som et nyttigt redskab til direkte billeddannelse af polysomer i lavere eukaryoter ^29-33 og mennesker ^27. I forhold til EM, AFM kræver ingen prøve fiksering eller mærkning. Desuden kan målinger udføres i nær fysiologiske forhold og med den unikke mulighed for klart at identificere både ribosomer og nøgne RNA-strenge ^27. kan udføres Imaging af enkelte polysomer relativt hurtigt, at få tusindvis af billeder på nano-opløsning med lidt efterbehandling indsats i forhold til den omfattende og tunge efterbehandling og genopbygning krævede analyser cryo-EM mikroskopi. Derfor ikke AFM håndtering og analyse af data ikke behøver dyre arbejdsstationer og høj computerkraft. Som sådan er denne teknik indsamler information om polysomalt former, morfologiske karakteristika (såsomhøjde, længde og bredde), ribosom densiteter, tilstedeværelsen af frit RNA og antallet af ribosomer pr polysom ^​​27 med et højere gennemløb end kryo-EM. I en sådan måde, AFM repræsenterer en stærk og komplementær tilgang til EM teknikker til at skildre polysomer ^27.

Her præsenterer vi en komplet rørledning fra rensning til dataanalyse, hvor AFM anvendes på billedet og analysere musehjerne polysomer. Den foreslåede protokol fokuserer på rensning spørgsmål og den nøjagtige deponering af polysomer på glimmer substrater, der anvendes til AFM billeddannelse. Ud over traditionel partikel analyse, der let kan udføres med fælles software bruges af AFM samfund, en ImageJ ³⁴ plugin, kaldet RiboPick, præsenteres for at tælle antallet af ribosomer pr polysom ^{​​27, 35.}

Protocol

De metoder, der anvendes til at opnå musen væv blev godkendt af organ for beskyttelse af dyr (OPBA) ved universitetet i Trento (Italien), protokol nr. 04-2015, som pr Art.31 lovdekret nr. 26/2014. Alle mus blev fastholdt på modelorganismen Facility for Center for Integrativ Biologi (CIBIO), University of Trento, Italien. Forsigtig: For at undgå enhver RNA-nedbrydning af prøverne, forberede alle buffere bruger DEPC-behandlet vand til minimering RNase forurening. 1. Fremstilling af Polysomer fra hele hj…

Representative Results

Saccharosegradient polysomalt profilering af hele musehjerne Det er muligt at oprense polysomer fra et cellulært lysat af polysomalt profilering, som adskiller makromolekyler i overensstemmelse med deres vægt og størrelse. Med polysomalt profilering, cytoplasmatiske lysater fremstillet ud fra dyrkede celler eller væv, såsom i dette eksempel er påført en lineær saccharosegradient og behandles af ultrace…

Discussion

Som strukturen af ​​DNA blev vist sig at være af afgørende betydning for at beskrive processen med transskription og afholdelse af kromatin avancerede vores forståelse af transkriptionel kontrol af genekspression, er det vigtigt at analysere organisation og struktur polysomer at forbedre sandfærdige forståelse oversættelse og dens regulering.

Med den beskrevne protokol, en optimal tæthed af polysomer forsigtigt immobiliseret på en flad overflade, opnås egnet til AFM billeddannel…

Materials

Cycloheximide	Sigma	01810	Prepararation of lysate
DNAseI	Thermo Scientific	89836	Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor	Life technologies	EO-0381	Prepararation of lysate
DEPC	Sigma	40718	Prepararation of lysate
Triton X100	Sigma	T8532	Prepararation of lysate
DTT	Sigma	43815	Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750	Prepararation of lysate
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Prepararation of lysate
Sucrose	Sigma	S5016	Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima LE-80K	Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW 41 Ti	Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube	Beckman Coulter	331372	Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	Sucrose gradient fractionation
AFM	Asylum Research	Cypher	Polysome visualization