Peering på Brain Polysomes med Atomic Force Microscopy

Summary

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Abstract

Den translasjonsforskning maskiner, dvs. polysome eller polyribosome, er en av de største og mest komplekse cytoplasmatiske machineries i cellene. Polysomes, dannet av ribosomer, mRNA-er, flere proteiner og ikke-kodende RNA, representerer integrert plattformer der translasjonelle kontroller finner sted. Men mens ribosomet har blitt mye studert, organisering av polysomes fortsatt mangler fullstendig forståelse. Således mye anstrengelse er nødvendig for å belyse polysome organisasjon og en hvilken som helst ny mekanisme for translasjons-kontroll som kan være innebygd. Atomic force mikroskopi (AFM) er en type scanning probe mikroskopi som gjør at kjøpet av 3D-bilder på nanonivå oppløsning. Sammenlignet med elektronmikroskopi (EM) teknikker, en av de viktigste fordelene med AFM er at det kan skaffe seg tusenvis av bilder både i luft og i løsning, slik at prøven som skal holdes under nær fysiologiske betingelser uten behov for farging og fiksering prodyrer. Her er et detaljert protokoll for nøyaktig rensing av polysomes fra musehjerne og deres avsetning på glimmer substrater er beskrevet. Denne protokollen gjør polysome bildebehandling i luft og væske med AFM og deres rekonstruksjon som tredimensjonale objekter. Komplementær til Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), kan den foreslåtte metoden enkelt brukes til systematisk å analysere polysomes og studere deres organisasjon.

Introduction

Syntesen av protein er den mest energikrevende prosess i celler ^1,2. Derfor er det ikke overraskende at protein Forekomsten er i hovedsak kontrollert ved det translasjonelle i stedet for transkripsjonsnivået ^3,4,5. Den polysome er den grunnleggende makromolekylære komponent som konverterer mRNA informasjonen inn i funksjonelle proteinavlesninger. Polysomes er så langt anerkjent som makromolekylære komplekser der flere translasjonsforskning kontroller møtes ^6-13. Til tross for hundrevis av studier på ribosom struktur ^{14- 16,} har de detaljerte molekylære innsikt i dynamikken i oversettelse og topologien av polysomes oppstått et begrenset interesse. Som en konsekvens, organisering av de innfødte polysomal ribonucleoprotein komplekse og dens virkning på muligheten oversettelse er fortsatt ganske obskure saker. Polysomes kan skjule fortsatt ukjent bestilt og funksjonelle organisasjoner, potensielt speiling hvilke nucleosomes og epigenetisk controls har representert for transkripsjon feltet. Faktisk etterforskningen av denne spennende hypotese krever ytterligere studier og nye tekniske tilnærminger. I denne linjen, kan strukturelle teknikker og atomic force mikroskopi motivert samarbeide for å løse nye mekanismer for å styre genekspresjon, på samme måte som det som ble oppnådd for nucleosome ^17,18.

Siden oppdagelsen av ribosomet ^14-16, har dens struktur blitt grundig karakterisert ved prokaryoter ^19,20, gjær ²¹ og mer nylig i human ^22, som gir den molekylære beskrivelse av mekanismene på basis av proteinsyntesen. Polysomes ble først anerkjent på membranen av det endoplasmatiske retikulum, danner typiske 2D geometriske organisasjoner ^14. Som nevnt tidligere, har polysome sammenstillingen ikke vært gjenstand for konstant interesse som ribosomet struktur. I det siste har polysomes blitt studert i hovedsak av transmission EM-baserte teknikker. Bare nylig, cryo-EM teknikker aktivert 3D-rekonstruksjon av renset polysomes fra in vitro oversettelsessystemer ^23-26, menneskelige cellelysatene ²⁷ eller i celler ^28. Disse teknikkene tilbudt mer raffinert informasjon om ribosom-ribosom organisasjon i polysomes ^{23, 26-28} og en foreløpig molekylær beskrivelse av kontaktflatene på tilstøtende ribosomer i hvetekim polysomes ^24. Dermed kan cryo-EM tomografi offentliggjøring av ribosom-ribosom interaksjoner med molekylær detalj, men det er tynget av omfattende etterbehandling og gjenoppbygging analyser som krever tunge beregningsressurser for datahåndtering. Videre, for å få den molekylære detalj av ribosom-ribosom interaksjoner, kreves et svært løst kart over ribosom, og denne typen referansen ribosom er kun tilgjengelig for noen få arter. Viktigere er cryo-EM tomografi ikke i stand til å oppdage gratis RNA. Therefmalm, nye teknikker som kreves for å fullt ut forstå organiseringen av oversettelses maskiner.

Foruten cryo-EM, har AFM er også ansatt som et nyttig verktøy for direkte avbildning av polysomes i lavere eukaryoter ^29-33 og mennesker ^27. Sammenlignet med EM, krever AFM ikke prøve fiksering eller merking. I tillegg kan målinger utføres i nærheten av fysiologiske betingelser og med en unik mulighet til klart å identifisere både ribosomer og nakne RNA tråder ^27. Imaging av enkelt polysomes kan utføres relativt raskt, skaffe tusenvis av bilder på nano-oppløsning med lite etterbehandling innsats i forhold til den omfattende og tung etterbehandling og gjenoppbygging analyser som kreves av Cryo-EM mikroskopi. Derfor gjør AFM databehandling og analyse ikke trenger dyre arbeidsstasjoner og høy datakraft. Som sådan, samler denne teknikken informasjon om polysomal former, morfologiske egenskaper (så somhøyde, lengde og bredde), ribosom densiteter, tilstedeværelse av fri RNA og antallet ribosomer pr polysome ²⁷ med en høyere gjennomstrømning enn cryo-EM. I en slik måte, representerer AFM en kraftig og komplementær tilnærming til EM teknikker for å portrettere polysomes ^27.

Her presenterer vi en komplett rørledning fra rensing til dataanalyse hvor AFM brukes til bilde og analysere mus hjernen polysomes. Den foreslåtte protokoll fokuserer på renseproblemer og på den nøyaktige avsetning av polysomes på glimmer substrater som brukes for AFM avbildning. I tillegg til konvensjonell partikkelanalyse som lett kan utføres med vanlig programvare som brukes av AFM samfunnet, en ImageJ ³⁴ plugin, kalt RiboPick, blir presentert for å telle antall ribosomer pr polysome ^{27, 35.}

Protocol

Den praksis brukes for å få muse vev ble godkjent av Body for beskyttelse av dyr (OPBA) ved Universitetet i Trento (Italia), protokoll nr. 04-2015, som per Art.31 lovdirektiv no. 26/2014. Alle mus ble opprettholdt på modellorganisme Facility for Senter for Integrative Biology (CIBIO), Universitetet i Trento, Italia. Forsiktig: For å unngå enhver RNA degradering av prøvene, forberede alle buffere ved hjelp DEPC-behandlet vann for å minimere RNase forurensning. 1. Utarbeidelse av Polysomes fra Whole B…

Representative Results

Sukrose gradient polysomal profilering av hele musen hjernen Det er mulig å rense polysomes fra et cellulært lysat av polysomal profilering, som skiller makromolekyler i henhold til deres vekt og størrelse. Med polysomal profilering, cytoplasmatiske lysatene oppnådd fra dyrkede celler eller vev, slik som i dette eksemplet er lastet opp på en lineær sucrose-gradient og behandlet ved ultrasentrifugering fo…

Discussion

Etter hvert som DNA-strukturen ble vist seg å være av største viktighet for å beskrive prosessen av transkripsjon og som organisering av kromatin utvidet vår forståelse av transkripsjonen kontroll av genekspresjon, er det viktig å analysere organiseringen og strukturen av polysomes å forbedre sant forståelse av oversettelse og regulering.

Med den beskrevne protokoll, en optimal tetthet av polysomes forsiktig immobilisert på en flat overflate, egnet for avbildning AFM oppnås. Ved h…

Materials

Cycloheximide	Sigma	01810	Prepararation of lysate
DNAseI	Thermo Scientific	89836	Prepararation of lysate
RiboLock RNAse Inhibitor	Life technologies	EO-0381	Prepararation of lysate
DEPC	Sigma	40718	Prepararation of lysate
Triton X100	Sigma	T8532	Prepararation of lysate
DTT	Sigma	43815	Prepararation of lysate
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750	Prepararation of lysate
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Prepararation of lysate
Sucrose	Sigma	S5016	Sucrose gradient preparation
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima LE-80K	Sucrose gradient centrifugation
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	SW 41 Ti	Sucrose gradient centrifugation
Polyallomer tube	Beckman Coulter	331372	Sucrose gradient centrifugation
Density Gradient Fractionation System	Teledyne Isco	67-9000-176	Sucrose gradient fractionation
AFM	Asylum Research	Cypher	Polysome visualization