While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
A maquinaria de tradução, ou seja, o polysome ou polyribosome, é uma das maiores e mais complexas máquinas citoplasmáticos nas células. Polissomos, formadas por ribossomas, mRNAs, várias proteínas e RNAs não-codificantes, representam plataformas onde os controles de translação ocorrem integrado. No entanto, enquanto o ribossomo tem sido amplamente estudada, a organização do polissomos carece ainda de compreensão abrangente. Assim, muito esforço é necessário, a fim de elucidar a organização polissoma e qualquer novo mecanismo de controlo de tradução que pode ser incorporado. microscopia de força atômica (AFM) é um tipo de microscopia de varredura por sonda que permite a aquisição de imagens 3D em resolução nanoescala. Em comparação com técnicas de microscopia electrónica (ME), uma das principais vantagens da AFM é que ele pode adquirir milhares de imagens, tanto no ar e em solução, permitindo que a amostra a ser mantida sob condições fisiológicas próximo, sem qualquer necessidade de coloração e fixação próprocedimentos. Aqui, um protocolo detalhado para a purificação precisa da polissomos de cérebro do rato e sua deposição em substratos de mica é descrito. Este protocolo permite a imagiologia polissoma no ar e líquido com a AFM e a sua reconstrução de objectos tridimensionais. Complementar ao microscópio crio-elétron (crio-EM), o método proposto pode ser convenientemente utilizado para analisar sistematicamente polissomos e estudar sua organização.
A síntese de proteínas é o processo que consome mais energia nas células 1,2. Por isso, não surpreende que a abundância de proteína são controladas principalmente para a translação em vez de 3,4,5 nível da transcrição. O polissoma é o componente macromolecular fundamental que converte a informação em leituras de ARNm proteicos funcionais. Os polissomas são até agora reconhecida como complexos macromoleculares, onde vários controlos traducionais convergem 6-13. Apesar das centenas de estudos sobre a estrutura do ribossoma 14- 16, os insights moleculares detalhados sobre a dinâmica da tradução e da topologia da polissomos encontrou um interesse limitado. Como consequência, a organização do complexo polissomal ribonucleoprote�a nativa e seu efeito potencial sobre a tradução ainda são questões bastante obscura. Polissomos pode esconder organizações ordenadas e funcionais ainda desconhecidos, potencialmente um reflexo do que nucleossomos e contro epigenéticals ter representado para o campo de transcrição. Na verdade, a investigação desta hipótese intrigante requer estudos adicionais e novas abordagens técnicas. Nesta linha, as técnicas estruturais e de microscopia de força atômica pode proveitosamente colaboram para desvendar novos mecanismos para controlar a expressão do gene, à semelhança do que foi conseguido para a nucleossomo 17,18.
Desde a descoberta do ribossoma 14-16, a sua estrutura foi extensivamente caracterizado em procariotas, levedura 19,20 21 e, mais recentemente, em 22 humana, proporcionando a descrição molecular dos mecanismos na base da síntese de proteínas. Polissomas foram reconhecidos inicialmente na membrana do retículo endoplasmático, formando organizações geométricas 2D típicos 14. Como mencionado antes, polissoma montagem não tenha sido o objecto de interesse constante à medida que a estrutura do ribossoma. No passado, têm sido estudados polissomas essencialmente por trtécnicas ansmission EM-base. Só recentemente, técnicas de crio-EM permitiu a reconstrução 3D do polissomos purificados a partir in vitro sistemas de tradução 23-26, lisados celulares humanos 27 ou em células 28. Estas técnicas ofereceu informações mais refinado sobre a organização ribossomo-ribossomo em polissomos 23, 26-28 e uma descrição molecular preliminar das superfícies de contato dos ribossomas adjacentes em polissomos gérmen de trigo 24. Assim, a tomografia crio-EM permite a divulgação de interações ribossomas-ribossomo com detalhes molecular, mas é sobrecarregado por extensa pós-processamento e análise de reconstrução que exigem recursos computacionais pesadas para a manipulação de dados. Além disso, para obter os detalhes moleculares das interacções ribossoma ao ribossoma, um mapa altamente resolvidas do ribossoma é necessário, e este tipo de ribossoma de referência está disponível apenas para algumas espécies. É importante ressaltar que a tomografia crio-EM não é capaz de detectar RNA livre. Therefminério, novas técnicas são necessárias para compreender plenamente a organização da maquinaria de tradução.
Ao lado de crio-EM, AFM foi também empregado como uma ferramenta útil para a imagem latente direta de polissomos em eucariotos inferiores 29-33 e humanos 27. Em comparação com EM, AFM não requer a fixação da amostra ou rotulagem. Além disso, as medições podem ser efectuadas em condições fisiológicas próximo e com a possibilidade única de identificar claramente ambos os ribossomas e cadeias de ARN nus 27. Imagiologia de polissomos individuais podem ser realizadas de forma relativamente rápida, a obtenção de milhares de imagens em nano-resolução com pouco esforço pós-processamento em comparação com a extensa e pesada de pós-processamento e análises de reconstrução exigida por microscopia crio-EM. Consequentemente, AFM manipulação e análise de dados não precisa de estações de trabalho caras e poder de computação de alta. Como tal, esta técnica recolhe informação sobre formas polissomal, características morfológicas (tais comoaltura, comprimento e largura), densidades de ribossomas, a presença de RNA livre eo número de ribossomas por polysome 27 com um caudal superior a crio-EM. Em tal forma, AFM representa uma abordagem poderosa e complementar às técnicas de EM para retratar polissomos 27.
Aqui nós apresentamos um gasoduto completa de purificação para análise de dados, onde AFM é aplicado à imagem e analisar polissomos cérebro do rato. O protocolo proposto concentra-se em problemas de purificação e na deposição precisa de polissomas em substratos de mica que são usados para imagiologia AFM. Além da análise convencional de partícula que pode ser facilmente realizada com o software comum utilizado pela comunidade AFM, um plug-in ImageJ 34, chamado RiboPick, é apresentado para a contagem do número de ribossomas por polissoma 27, 35.
Como a estrutura do DNA foi provado ser de suma importância para descrever o processo de transcrição e como a organização da cromatina avançado nossa compreensão do controle transcricional da expressão do gene, é essencial analisar a organização e estrutura do polissomos para melhorar a compreensão verdadeiras da tradução e da sua regulação.
Com o protocolo descrito, uma densidade óptima de polissomas suavemente imobilizados sobre uma superfície plana, adequados para imagio…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |