While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
La maquinaria de traducción, es decir, el polisomas o polyribosome, es uno de los mecanismos citoplásmicos más grandes y más complejos en las células. Polisomas, formadas por los ribosomas, ARNm, varias proteínas y ARN no codificantes, representan plataformas donde los controles se llevan a cabo de traslación integrado. Sin embargo, mientras que el ribosoma se ha estudiado ampliamente, la organización de polisomas todavía falta comprensión global. Por lo tanto se requiere un gran esfuerzo con el fin de dilucidar organización polisomas y cualquier nuevo mecanismo de control de la traducción que puede ser embebido. Microscopía de fuerza atómica (AFM) es un tipo de microscopía de barrido de la sonda que permite la adquisición de imágenes en 3D con una resolución de escala nanométrica. En comparación con técnicas de microscopía electrónica (EM), una de las principales ventajas de AFM es que se puede adquirir miles de imágenes tanto en el aire y en solución, lo que permite que la muestra se mantendrá en condiciones fisiológicas cerca sin necesidad de tinción y la fijación de proprocedimientos. Aquí, se describe un protocolo detallado para la purificación exacta de polisomas de cerebro de ratón y su deposición sobre sustratos de mica. Este protocolo permite obtener imágenes polisomas en el aire y líquido con AFM y su reconstrucción como objetos tridimensionales. Complementario al crio-microscopía electrónica (crio-ME), el método propuesto puede ser utilizado convenientemente para el análisis sistemático de polisomas y el estudio de su organización.
La síntesis de proteínas es el proceso que consume más energía en las células de 1,2. Por lo tanto, no es sorprendente que las abundancias de proteínas son controlados principalmente en la traslación en lugar de 3,4,5 nivel transcripcional. El polisomas es el componente macromolecular fundamental que convierte la información de ARNm en lecturas proteicos funcionales. Polisomas son hasta ahora reconocidos como complejos macromoleculares donde varios controles de traslación convergen 6-13. A pesar de cientos de estudios sobre la estructura del ribosoma 14- 16, los conocimientos moleculares detallados sobre la dinámica de la traducción y la topología de polisomas ha detectado un interés limitado. Como consecuencia de ello, la organización del complejo de ribonucleoproteína polisomico nativo y su efecto potencial sobre la traducción son todavía temas bien oscuros. Polisomas pueden ocultar las organizaciones ordenados y funcionales aún desconocidos, potencialmente reflejando lo nucleosomas y contro epigenéticals han representado para el campo de la transcripción. De hecho, la investigación de este intrigante hipótesis requiere de estudios adicionales y nuevos enfoques técnicos. En esta línea, las técnicas estructurales y microscopía de fuerza atómica pueden colaborar fructíferamente para desentrañar nuevos mecanismos para el control de la expresión génica, de manera similar a lo que se logró para el nucleosoma 17,18.
Desde el descubrimiento del ribosoma 14-16, su estructura se ha caracterizado ampliamente en procariotas, levaduras 19,20 21 y más recientemente en humano 22, proporcionando la descripción molecular de los mecanismos en la base de la síntesis de proteínas. Polisomas se registran inicialmente en la membrana del retículo endoplasmático, formando organizaciones geométricas 2D típicos 14. Como se ha mencionado antes, polisomas asamblea no ha sido objeto de interés constante a medida que la estructura del ribosoma. En el pasado, se han estudiado polisomas esencialmente por trtécnicas ansmission EM-basa. Sólo recientemente, las técnicas de crio-EM permitieron la reconstrucción 3D de polisomas purificados a partir de sistemas de traducción in vitro 23-26, lisados celulares humanos en 27 o 28 células. Estas técnicas ofrecen información más precisa acerca de la organización de ribosomas ribosoma en polisomas 23, 26-28 y una descripción molecular preliminar de las superficies de contacto de los ribosomas adyacentes en polisomas germen de trigo 24. Por lo tanto, la tomografía crio-EM permite la divulgación de las interacciones de ribosomas ribosoma con detalle molecular, pero está cargado por una extensa post-procesamiento y análisis de reconstrucción que requiere recursos computacionales pesadas para el manejo de datos. Por otra parte, para obtener el detalle molecular de las interacciones de ribosomas ribosoma, se requiere un mapa de carreteras de resuelto de los ribosomas, y este tipo de ribosoma de referencia está disponible sólo para unas pocas especies. Es importante destacar que, tomografía crio-EM no es capaz de detectar RNA libre. Therefel mineral, se requieren nuevas técnicas para entender completamente la organización de la maquinaria de traducción.
Al lado de la crio-EM, AFM ha sido también empleado como una herramienta útil para obtener imágenes directas de polisomas en eucariotas inferiores 29-33 y los seres humanos 27. En comparación con EM, AFM no requiere la fijación de la muestra o el etiquetado. Además, las mediciones se pueden llevar a cabo en condiciones fisiológicas cerca de y con la posibilidad única de identificar claramente los dos ribosomas y cadenas de ARN desnudos 27. Obtención de imágenes de polisomas individuales se puede realizar de forma relativamente rápida, obteniendo miles de imágenes en nano-resolución con poco esfuerzo post-procesamiento en comparación con la extensa y pesada de post-procesamiento y análisis de la reconstrucción requerida por microscopía de crio-EM. En consecuencia, AFM manejo y análisis de datos no necesita caras estaciones de trabajo y potencia de computación de alto. Como tal, esta técnica recoge información sobre formas polysomal, características morfológicas (por ejemplo,altura, longitud y anchura), las densidades de ribosomas, la presencia de ARN libre y el número de ribosomas por polisomas 27 con un rendimiento más alto que la crio-EM. De tal manera, AFM representa un enfoque poderoso y complementario a las técnicas de EM para retratar polisomas 27.
Aquí presentamos una tubería completa de purificación para el análisis de datos en la que se aplica a la imagen de AFM y analizar polisomas cerebro de ratón. El protocolo propuesto se centra en cuestiones de purificación y en la deposición precisa de polisomas sobre sustratos de mica que se utilizan para obtener imágenes de AFM. Además del análisis de partícula convencional que puede ser fácilmente realizó con el software común usado por la comunidad AFM, un plugin de ImageJ 34, llamado RiboPick, se presenta para contar el número de ribosomas por polisomas 27, 35.
Como la estructura del ADN fue demostrado ser de suma importancia para describir el proceso de la transcripción y la organización de la cromatina avanzada nuestra comprensión de control transcripcional de la expresión génica, es esencial para analizar la organización y estructura de polisomas para mejorar la comprensión veraz de la traducción y su regulación.
Con el protocolo descrito, una densidad óptima de polisomas suavemente inmovilizados sobre una superficie plana, se obtiene …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |