Abstract
As células endoteliais estão alinhados na parede interna dos vasos sanguíneos e desempenham um papel importante na regulação do tónus vascular, da permeabilidade vascular, e nova formação vascular. disfunção das células endoteliais está implicada no desenvolvimento e progressão de muitas doenças cardiovasculares, incluindo doença cardíaca isquémica. Para examinar a função e caracterização de células endoteliais coronárias, o isolamento de células é o primeiro passo e exige elevado grau de pureza e a quantidade para conduzir experiências subsequentes. Este protocolo descreve um método eficiente para isolar ratinho adulto células endoteliais coronárias. O coração do rato é dissecado e picada em pedaços pequenos. Após a digestão do coração utilizando colagenase e dispase II, as células são lavadas e incubadas com esferas magnéticas que são conjugados com o anticorpo anti-CD31. As contas com células endoteliais são lavadas várias vezes e está pronto para usar em várias aplicações, incluindo imagens e experime biológica molecularNTS. Isolamento eficiente rende aproximadamente 10 4 células por um coração com mais de 90% de pureza.
Introduction
modelos de ratinho de várias doenças cardiovasculares e desordens metabólicas suportar mudanças fisiológicas e moleculares que são semelhantes aos encontrados em pacientes. Além disso, a alteração genética de ratinhos é uma ferramenta poderosa que nos permite investigar o papel patogénico de genes específicos no desenvolvimento e progressão de doenças. Hoje em dia, o gene-knock-in específico de células-tipo ou ratinhos -out podem ser facilmente gerados em muitos laboratórios e a medição de ARNm e os níveis de proteína em tipos específicos de células é o primeiro passo para determinar se os ratos foram verdadeiramente geneticamente modificado.
O endotélio é uma camada única fina de células endoteliais (ECs) que reveste a parede vascular interior. As células endoteliais desempenham um papel crítico na regulação da tensão vascular, da permeabilidade vascular, e nova formação vascular 1,2. A disfunção endotelial é uma característica de muitas condições patológicas e alterações na função endotelial pode conduzir a vários carrosdoenças cardiovasculares 3,4. É, assim, importante para estudar a função das células endoteliais em condições fisiológicas e fisiopatológicas.
Existem várias maneiras de isolar ECs 5-8 e o método de isolamento tem que ser optimizado dependendo de qual tecidos e espécies serão utilizados. Isto é porque CEs a partir de diferentes tecidos apresentam um elevado nível de heterogeneidade no que diz respeito aos seus marcadores de superfície e expressão da proteína 9. isolamento de células endoteliais pode muitas vezes ser um desafio e requer algum grau de treinamento e prática. Uma vez alcançada, o método de isolamento proposto neste protocolo revela-se estável e eficiente.
O objetivo geral deste método é a obtenção de rato ECs coronariana (MCECs) de alta qualidade e quantidade. Embora a quantidade de células recolhidas a partir de um coração é menos do que as células recolhidas a partir de outros tecidos, utilizando outras técnicas, esta técnica ainda proporciona apostaqualidade ter. A pureza das células endoteliais na população resultante é maior do que 90%. Assim, essa técnica seria o ideal para aplicações que dependem de células endoteliais puramente isolados, como imagens de células.
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Protocol
A pesquisa em ratos foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Arizona e foi realizada de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) orientações.
NOTA: Seções 1, 2 e 3 devem ser realizadas um dia antes do experimento, como a instalação.
1. Soluções Preparando
- tampão de CD31 (50 ml)
- Adicionar 50 ml de 1 x tampão fosfato salino (PBS) a um tubo de 50 ml. Pesar 0,05 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 0,037 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e adicionar ao tubo de 50 ml e colocar o tubo para rodar durante cerca de 1 hora até dissolver o pó. Ajustar o pH para 7,4, filtrar através de um filtro de 0,2 um para um novo tubo de 50 ml e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
- Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) com HEPES (500 ml)
- Adicionar 1,1915 g de HEPES fazer HEPES 10 mM em HBSS solução e misturar bem. Medir o pH e ajustar para 7,4. Filtrar e armazenar a 4C.
- A solução de Kreb 1x (1 L)
- Adiciona-se 100 ml de solução de Krebs × 10 [Tabela 1] para se dobrar de água destilada em um balão de 1 L. Pesar 2,1 g de bicarbonato de sódio e 2 g de D-glucose e adiciona-se ao balão. Misture e ajustar o volume total de 1 L.
- Solução de bolha com 95% de O2 / 5% de CO 2 gasoso durante 30 minutos e solução de filtro no interior do exaustor. Armazenar a 4 ° C e manter em gelo durante o experimento.
2. Preparar as esferas magnéticas
- Adicionar 1 ml de tampão de CD31 em cada tubo de 1,5 ml (um tubo por amostra). Misture as ovelhas anti-ratos contas de IgG e adicione a quantidade adequada a cada amostra [Tabela 1]. Agite os tubos vigorosamente 30 vezes e colocá-los no prato magnético durante 1 min de agitação. Abrir os tubos, enquanto no prato e despejar as soluções dentro de um balde.
- Adicionar 1 ml de tampão de CD31 em cada tubo. Adicionar 2 mL de rato anti-CD31 anticorpo a cada tubo e girar tubos O / N a 4 ºC.
3. A autoclavagem
- Autoclave todas as ferramentas de cirurgia e ponteiras. Corte as pontas de pontas de pipeta de modo que há dicas com 4 diâmetros diferentes, de mais vasto para mais estreito. diâmetros aproximados para as pontas são de 3 mm, 2,5 mm, 2 mm e 1,5 mm, respectivamente. Cortar as pontas e a autoclave dias antes com 30 min de esterilização a uma temperatura de 121 ºC.
NOTA: As secções 4-11 deve ser levada a cabo no dia da experiência.
4. Soluções Preparando
- Prepare tampão de lavagem contendo 2% de ferro-fortificada Calf Serum (IFCS) em M199. Para geração de imagens, preparar 30 ml / mouse.
- Preparar a solução de enzima (10 mL / amostra). Pesar 0,6 unidade / ml de Dispase e 1 mg / mL de colagenase tipo II para um tubo de 50 ml. Adicionar M199 e girar o tubo a 4 ºC durante 15 min. Filtra-se através de filtro de 0,2 um para um novo tubo de 50 ml inside o capô e manter a 4 ° C até o uso.
- Prepare HBSS / HEPES com heparina. Adicionar 10 ml de HBSS com 10 mM de HEPES em 15 ml de tubo. Adicionar 100 ul de heparina para o tubo e manter a 4 ° C até à sua utilização.
5. lavagem das pérolas
- Retire os tubos com contas do rotator a 4 ºC e trazer para a capa. Colocar os tubos na placa magnética e agitar durante 1 min. Despejar a solução e adicionar 1 ml de tampão de CD31 em cada tubo.
- Pegue os tubos fora da placa magnética e agitar vigorosamente 30 vezes. Colocar os tubos em volta da placa magnética e repetir para um total de 3 lavagens. Após a conclusão, colocar os tubos de volta à 4C e continuar girando até o uso.
6. Dissecção
- Injectar os ratinhos intraperitonealmente com 0,1 ml de heparina para evitar a coagulação do sangue. Esperar 10 minutos, em seguida, anestesiar os ratos usando injeção intraperitoneal de 0,01 ml de pentobarbital. Verifique se o mouse está sentindodor, apertando o pé.
- Posicione o mouse em uma placa de poliestireno com a cabeça para cima e mantenha os braços com pinos. Use uma pinça e difíceis-CUT-tesoura para cortar a pele na região torácica superior até a garganta.
- Fazer um corte no centro da caixa torácica logo acima do diafragma. Cortar o osso para os lados e para cima para a garganta para fazer um triângulo expor o coração e os pulmões. Cortar a aorta logo acima do diafragma.
- Segure o timo com uma pinça sem puxar e usar uma tesoura para cortar qualquer tecido conjuntivo com cuidado para remover pulmões e coração juntos. tecidos lugar em um copo com 1 × Kreb de, agitar com uma pinça e transferir para 6cm de prato com 1 × Kreb de.
- Retire os lobos pulmonares, utilizando tesouras e pinças. Inserir um cateter estéril de 20 G para a aorta. Lave o sangue no sistema circulatório coronária com HBSS / heparina. Fazer um pequeno corte no ventrículo, agitar o coração e transferir para um tubo de amostra de M199. Mantenha os tubos em gelo.
- Transferir o coração a um disco de 6 cm cheia com 10 ml de solução de enzima e mediu-lo em pequenos pedaços com uma tesoura. Coloque os pratos na incubadora a 37 ºC durante 15 min. Agitar materiais digeridos por pipetagem cima e para baixo 30 vezes através de uma ponta com uma extremidade cortada para permitir que o tecido a passar por mais fácil.
- Coloque-o de volta na 37 ºC incubadora por mais 15 min. Repita agitação três vezes, cada vez com pontas de pipeta de maiores aberturas para mais estreito e 15 minutos de incubação entre cada.
- Depois da última 15 min de incubação, colher amostras para fora e para dentro do capô. Pipetar solução cima e para baixo 30 vezes utilizando ponta da pipeta com a abertura mais estreita e passar através de um filtro de 40 | iM de células para um novo tubo de 50 ml.
- Lava-se a placa com 10 ml de tampão de lavagem, utilizando uma pipeta de 10 ml e transferir para filtro de células. Colocar os tubos de 50 ml de centrífuga e centrifugação a 400 g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Lavar as células com 5 ml de tampão de lavagem por duas vezes.
- Obter um dos anteriormente preparados tubos de 1,5 ml com grânulos e trabalho em um tubo de cada vez. Coloque um tubo de 1,5 ml na placa magnética, agitar 3 vezes e abri-lo.
- Após a última centrifugação, remover tanto sobrenadante quanto possível, sem perturbar o sedimento. Dissociar os aglomerados de células sacudindo vigorosamente.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem para o tubo de 50 mL e misturar as células com uma pipeta de 1 ml. Despejar a solução a partir do tubo de 1,5 ml e adicionar 1 ml de suspensão de células a partir do tubo de 50 mL para os grânulos. Flick os tubos de 30 vezes, em seguida, gire a 4 ºC durante 30 minutos.
9. Preparação para Cultura de Células / Imagem
- Prepare câmaras para as células plaqueamento. Adicionar solução de gelatina (5% w / v, 300 mL) para a câmara bem para cobrir a superfície e incuba-se durante 30 min a 37 ºC. Após a incubação, REMgelatina ove e secar a superfície.
- Retire os tubos com contas / células após 30 min de rotação e colocar na placa magnética no interior do exaustor. Agita-se durante 2 min, despejo e adicionar 1 ml de tampão de lavagem.
- Tome tubos para fora da placa, agitar vigorosamente 30 vezes em seguida, agite 30 vezes. Colocá-los de volta na placa magnética e agitar durante 1 min. Repetir 4 vezes, para um total de 5 lavagens, mas com 1 min de agitação sobre a placa.
- Após a última lavagem, retirar um tubo e trabalhar em cada um tubo de cada vez. Agite 30 vezes em seguida, agite 30 vezes. Coloque-o sobre a placa magnética e agitar durante 1 min. Despejar e adicionar 1 ml de 20% de mídia IFCS CE (pré-aquecido a 37 ºC).
- Agita-se vigorosamente 30 vezes em seguida, agite 30 vezes. Ajuste pipeta para 500 mL e pipeta cima e para baixo 10 vezes. Transferir 500 ul a cada câmara.
- Coloque a 37 ºC incubadora e deixar O / N. No dia seguinte, lave as células com 10% de media FBS CE.
10. Preparação para Blot As amostras (BM) ocidentais
- Takum e os tubos com contas / células após 1 hora de rotação. Colocá-los na placa magnética e agitar por 2 min. Despejar o sobrenadante e adicionar 1 ml fria HBSS. Agita-se vigorosamente 30 vezes em seguida, agite 30 vezes. Repita duas vezes para 3 lavagens, mas com 1 min de agitação sobre a placa.
- Depois da última lavagem, colocar tubos na placa magnética e agitar durante 1 min. Remover o tampão usando uma pipeta e lisar as células de WB utilizando um método previamente descrito 11,12. lisado foi recolhido normalmente contém cerca de 30 ug de proteína.
11. Imagem
- Lave as células 3 vezes com a mídia, com volume final de 250 ul de uma câmara. Adicionar 1,5 mL de AcLDL-Dil para as células. A partir deste ponto, manter as células no escuro.
- Incubar por 3,5 horas a 37 ° C. Adicionar 1,5 uL de Hoechst, misturar bem e incubar durante 30 min a 37 células ˚C.Wash com PBS e fixar com 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min à TA.
- Lavar duas vezes com PBS e bloquear com 5% de BSA-PBS, durante 30 min à temperatura ambiente. Lavar duas vezes com 1% de BSA-PBS. Diluir BS-lectina-FITC utilizando 1% de BSA-PBS a uma concentração de 2 ug / ml e adicionar 300 ul a cada câmara.
- Coloque a câmara no agitador orbital, à temperatura ambiente durante 30 min. Lavar com PBS 3 vezes.
- Visualizar as células sob o microscópio de fluorescência com o tempo de exposição de 200 ms para FITC (coloração com lectina, um marcador CE, excitação / emissão a 488 nm / 519 nm), 30 ms para DAPI (Hoechst, uma coloração, de excitação / emissão nuclear a 358 nm / 461 nm), e 300 ms para TRITC (coloração AcLDL, um marcador CE, excitação / emissão a 557 nm / 576 nm). Adquirir imagens usando uma lente objetiva de 20X.
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Representative Results
O isolamento de células endoteliais coronárias de um coração de rato normalmente produz cerca de 10 4 células com mais de 90% de pureza com uma forma de paralelepípedos. Para uma população pura de células endoteliais, o cuidado deve ser tomado ao longo do protocolo para garantir um ambiente estéril livre de qualquer contaminação. O aparecimento de células alongadas ou células alargada dentro da população indica contaminação com outros tipos de células, as células do músculo liso e f ibroblastos. Endotelial teste de pureza de células é realizada por coloração das células com um marcador da superfície das células endoteliais, BS-LECTINA e AcLDL (Figura 1). A percentagem de células positivas que apresentam ambas as cores era mais de 90% em CMEB. Tal resultado indica que a técnica foi executada com sucesso.
| PBS (10x) (1 L) | </ Td> | ||
| Material | MW | Quantidade (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136,08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| Material | MW | Conc (mM) | Quantidade (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74,56 | 4.7 | 3,5 |
| CaCl 2 2H 2 O • | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 7H 2 O • | 246,5 | 1.2 | 2.96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1,44 |
| CE Meios (20%) (500 ml) | |||
| Material | Quantidade | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10-20 U / ml de heparina | 500 ul | ||
| D-Valina | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicilina / Estreptomicina | 5 ml | ||
| Quantidade de grânulos a serem utilizados para um rato | |||
| para imagiologia | 5 ul | ||
| Fou WB / PCR | 10 ul | ||
Tabela 1. As composições químicas das soluções utilizadas.
Figura 1. As imagens representativas de imagens MCECs. Fluorescência mostram que rato ECs coronariana (CMEB) isolado de corações apresentam elevado grau de pureza da população CE. A pureza foi testada por AcLDL tanto a absorção de cor vermelha (A) e coloração com lectina na cor verde (B) em CMEB. O núcleo foi corado pela Hoechst na cor azul (C). A percentagem de células positivas que apresentam ambas as cores era mais de 90% em CMEB. Bar é representativa de 20 um. Por favor clique aqui para ver uma vers maioresion desta figura.
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Discussion
As células endoteliais mais utilizados na pesquisa são células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) por causa de sua conveniência e facilidade de cultivo. No entanto, uma grande quantidade de pesquisa requer a disponibilidade de um modelo fisiológico atingido pelo isolamento de células endoteliais específicas de outros órgãos 10. As células endoteliais formam uma população muito reduzida das células no tecido do coração; seu isolamento e cultura pode revelar-se muito difícil.
Há três passos críticos dentro deste protocolo. O primeiro é para lavar bem sangue. Isto é necessário, como leucócitos dentro de sangue também expressam CD31 como um marcador da superfície celular, e vão competir contra ECs para a ligação do anticorpo CD31. Como outras células endoteliais pode também estar presente no sangue, a lavagem é essencial para prevenir a contaminação por essas células. O segundo passo essencial é a manutenção de um ambiente estéril durante todo o processo de isolamento. Qualquer resu contaminaçãoLTS em uma diminuição drástica no número de células atingido. Finalmente, o terceiro passo é crítico para ajustar o pH do tampão de CD31, como a incapacidade de fazer isso irá diminuir a eficiência do isolamento.
qualidade celular é mais importante durante esse isolamento. o crescimento de células do músculo liso pode ser inibida pela adição de uma quantidade apropriada de heparina ao meio de cultura. a proliferação de fibroblastos pode ser abrandado pela adição de D-valina para a mídia. As células endoteliais pode ser caracterizado por a absorção de Dil-AcLDL e co-coloração com BS-LECTINA, a fim de testar a pureza do fenótipo de células endoteliais população.O é instável e o seu comportamento pode mudar rapidamente, uma vez retirado do tecido original e culta. Uma limitação da técnica é que as células não devem ser usados após 5 dias de cultura para assegurar que ainda mantêm o seu fenótipo. Recomenda-se vivamente para não passar as células. As células primárias irá fornecer um resu consistentelt.
Em geral, a técnica resulta num bom número de células de pureza excelente. Com as habilidades necessárias, o processo de isolamento pode ser concluído no prazo de 6 horas. Ele fornece um excelente método para a obtenção de rato células endoteliais coronárias para qualquer cultura celular ou experiência biológica molecular.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão do National Institutes of Health (HL115578 para A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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