Abstract
Makrofager og dendritiske celler (DC'er) er medfødte immunceller findes i væv og lymfoide organer, der spiller en vigtig rolle i forsvaret mod patogener. De er imidlertid vanskeligt at isolere i tilstrækkeligt antal til at studere dem i detaljer, derfor har in vitro-modeller blevet udviklet. In vitro kulturer af knoglemarvafledte makrofager og dendritiske celler er veletablerede og værdifulde fremgangsmåder til immunologiske undersøgelser. Her beskrives en fremgangsmåde til dyrkning og identifikation både DC'er og makrofager fra en enkelt kultur af primære muse knoglemarvsceller ved hjælp af cytokin granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF). Denne protokol er baseret på den etablerede procedure først udviklet af Lutz et al. i 1999 for knoglemarv-afledte DC'er. Kulturen er heterogen, og MHCII og fluoresceineret hyaluronan (FL-HA) anvendes til at skelne makrofager fra umodne og modne DC'er. Disse GM-CSF afledt makrofager proVide en bekvem kilde til in vitro-afledte makrofager, der nøje ligner alveolære makrofager i både fænotype og funktion.
Introduction
Adskillige in vitro-dyrkning metoder er blevet beskrevet til at generere knoglemarvafledte makrofager (BMDMs) og knoglemarv-afledte DC'er (BMDCs) ved hjælp af en eller en kombination af vækstfaktorer. BMDMs kan genereres ved at dyrke knoglemarvsceller anvendelse af enten makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) eller GM-CSF 1,2. For BMDCs, tilsætning af FLT3-ligand til knoglemarven kultur giver anledning til ikke-adhærente klassiske og plasmacytoide DC'er (CD11c høj / MHCII høj og CD11c lo, B220 + henholdsvis) efter 9 dages dyrkning 3,4. I modsætning hertil frembragte ikke-adhærente celler efter 7 til 10 dages dyrkning med GM-CSF alene 5,6, GM-CSF og IL-4 7, eller GM-CSF og FLT3 ligand 8,9 generere BMDCs mere ligner inflammatoriske DC'er (CD11c høj, MHCII høj CD11 +) 10. Mens disse in vitro-kulturer anvendes til at generere makrofager ellerDC'er, er det uklart, om hver kultur giver anledning til rene populationer. For eksempel, selv om adhærente celler i GM-CSF-kulturer er beskrevet at være makrofager 5, de ikke-adhærente celler fra den samme kultur anvendes som DC'er 6,11-13, med den antagelse, at de er homogene og observerede variabilitet er på grund af forskellige udviklingstrin 14,15. Endvidere har undersøgelser vist, GM-CSF som en væsentlig vækstfaktor for alveolær makrofag udvikling in vivo 16,17, og kan anvendes in vitro til frembringelse af alveolære makrofager-lignende 16,17,18.
Andre end vedhæftning, procedurer for at generere makrofager og DCS fra GM-CSF behandlet knoglemarv kulturer er meget ens tyder heterogenitet kan eksistere inden for GM-CSF knoglemarv kulturer. Dette synes faktisk at være tilfældet, da to papirer rapporterer tilstedeværelsen af BMDMs i den ikke-klæbende del af BMDC kulturer. I én papir, de identified en population af celler som CD11c +, CD11 +, MHCII midten, MerTK +, og CD115 +, som udtrykte en genekspression signatur, mest lignede alveolære makrofager og havde en reduceret evne til at aktivere T-celler 19. Den anden papir, der anvendes MHCII og FL-HA til at identificere en alveolær makrofag-lignende population (CD11c +, MHCII mid / lav, FL-HA høj), der var forskellig fra umodne (CD11c +, MHCII mid, FL-HA lav) og moden DCs (CD11c +, MHCII høj), både fænotypisk og funktionelt 18. Disse papirer både illustrerer, at GM-CSF BMDC kulturer er heterogene, der indeholder både makrofag og DC populationer der angiver, at der bør udvises forsigtighed ved fortolkning af data fra BMDC kulturer.
Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer knoglemarv, kultur knoglemarvsceller i GM-CSF, og identificere den alveolære makrofag-lignendebefolkning fra de umodne og modne DC'er i knoglemarven kultur ved flowcytometri under anvendelse FL-HA-binding og MHCII ekspression. Denne procedure er baseret på den etablerede procedure af Lutz et al 6 og er i stand til at generere 5 -. 10 x 10 6 ikke-adhærente celler på dag 7 i en 10 ml kultur. Kulturen er anvendelig fra dag 7 til 10 og giver en heterogen population af makrofager, umodne og modne DC'er, samt nogle stamfædre på dag 7. Dette tilvejebringer en simpel metode til at vokse og isolere in vitro alveolær-lignende makrofager i store mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blev aflivet efter den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer for etisk dyr forskning ved procedurer, der er godkendt af University of British Columbia Animal Care udvalget.
1. Erhvervelse en enkelt celle Bone Marrow Suspension fra mus lårben og skinneben
- Tænd et biologisk sikkerhedsskab (BSC) 15 min før start af procedure at rense skab luft og give mulighed for stabilisering luftstrøm, så ren / spray BSC overflade med 70% ethanol. Hold alt så sterilt som muligt for helhed af protokollen. Skær ikke knoglerne under ikke-sterile betingelser.
- Forbered dissektion værktøjer ved opblødning i 70% ethanol (1 par dissektion saks, 2 par tænger), Hanks balancerede saltopløsning med 5% føtalt kalveserum (HBSS-FCS), sterile petriskåle (100 mm x 15 mm), 1 ml sprøjter, 26½ gauge nåle, indsamling rør koniske (15 ml eller 50 ml), og papirhåndklæder i BSC.
- Aflive musen ved hjælpprotokoller, der er godkendt af institutionens dyr videnskabsetisk komité. Sætter BSC, placere oven på en eller to papirservietter og spray musen med 70% ethanol.
- I BSC, åbne en steril petriskål aseptisk, alikvot 10 ml HBSS-FCS til basen og 1 - 2 ml til låget.
- Placer musen på maven med bagsiden opad og løft huden omkring thorax sektioner med fingrene på den ikke-dominerende hånd. Brug saks til at lave et snit, hvor huden løftes.
- Hold på begge ender af den afskårne, ene ende med hver hånd og træk forsigtigt fra hinanden huden omkring musen fra bagsiden til maven, fortsætte med at trække indtil to ender af indsnit mødes på maven.
- Flip musen til maven opad, og med den ene hånd at trække den nederste halvdel af huden ned mod benet, holde trækker tilbage i huden, indtil benene er udsat for.
- Hold foden af musen op og skær akillessene over ankelleddet ogledbånd, der forbinder musklerne til at betale ved den nedre ende af skinnebenet med en saks. Dette løsner foden fra ben knogler.
- Hold benet op af foden, skæres muskler og ledbånd med saks rundt knæleddet ved den nedre ende af lårbenet for at adskille lårmusklerne fra underbenet. Brug pincet til forsigtigt at trække løsnede musklerne væk fra fibular og femorale overflader. Pas på ikke at bryde den femorale arterie for at undgå kraftig blødning.
- Med den ene hånd holder på foden, skal du trykke ned åbne saks i den øvre ende af lårbenet i hofteleddet, rotere benet og træk forsigtigt at adskille lårbenet fra hofteleddet mens du bruger saks til at foretage den endelige cut til gratis benet fra kroppen.
- Fra dette tidspunkt, kun holde vævet med steril pincet. Hold på benet i den ene ende og træk foden på den anden.
BEMÆRK: Dette bør ikke kræve meget kraft, som forbinder ledbånd skæres i trin1.9. Alternativt skæres tibia lige over anklen, hvor knoglen er fusioneret. - Hold benet ved den distale ende af lårbenet med et sæt pincet og proximale ende af skinneben og lægben med en anden, omhyggeligt bøje skinneben og lægben i den modsatte retning af knæleddet at adskille dem fra lårbenet og patella.
- Brug pincet til at trække ned de resterende ledbånd og muskler stadig er knyttet til de lavere ben knogler. Her fjernes fibula sammen med bindevævet med pincet, som det er for lille til at blive skyllet af knoglemarvsceller. Placer den rensede skinneben på den omvendte petriskålen låg.
- Hold den nedre ende af femur med et sæt pincet og patella med en anden, bøje patella og omgivende væv i den modsatte retning af samlingen til fjernelse. Derefter rense ud resterende bindevæv fra lårbenet; trække dem væk med en pincet, og placere den på den inverterede petriskål låg. Kassér knæskallen.
- Gentag 1.7- 1.13 med det andet ben, hvis nødvendigt. Overfør knoglerne til 1,6 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml sterilt HBSS-FCS til transport, hvis det kræves.
- Placer knogler på den inverterede petriskål låg, med 1 - 2 ml HBSS-FCS pincet for at rense eventuelt resterende væv stadig fastgjort til tibia og femur, derefter overføre knoglerne til bunden af petriskålen indeholdende 10 ml HBSS- FCS. Alternativt, rense knoglerne og fjern vedhæftet muskelvæv ved hjælp af en 70% ethanol gennemblødt væv.
- Skær hver af knoglerne i halvdel med saks. Delvist skjold petriskålen med en steril låg mens der skæres for at sikre knoglerne blive i fadet. Alternativt skæres i slutningen af hver knogle for at tillade skylning i det næste trin.
- Sæt 26½ G nål videre til en ml sprøjte, og udarbejde en ml HBSS-FCS fra petriskålen. Sæt spidsen af nålen ind i enden af en knogle stykke og skylle ud knoglemarvsceller (bløde røde væv inde i knogler). Stik nålen ind i hovedetaf knoglen og den åbne ende, indtil alle de røde farvede marv fjernes. Overhold knoglerne som hvid farve.
- Pass synlige klumper af knoglemarv gennem sprøjten et par gange for at danne en enkelt celle suspension.
- Kassér de blussende knogler. Brug en 10 ml pipette for at blande cellesuspensionen godt og overføre til opsamlingsrøret. Skyl petriskålen en gang med 5 ml HBSS-FCS at indsamle resterende celler i skålen. Placer celler på is.
BEMÆRK: Cellesuspensionen knoglemarv stadig er levedygtig, hvis den opbevares til 2 - 3 timer ved 4 ° C.
2. Plating og Dyrkning af knoglemarvsceller (BMC'er)
- Forbered følgende reagenser og forsyninger.
- Forbered røde blodlegemer (RBC) lysepuffer ved at gøre 0,84% ammoniumchlorid i en endelig opløsning på 2 mM Tris pH 7,2, derefter steriliseres ved filtrering gennem et 0,2 mikrometer filter.
- Forbered BMC medier ved tilsætning af 10% FCS, 20 mM HEPES, 1 x ikke-essentielle aminosyre, 55 & #181; M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin og streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 2 mM L-glutamin til RPMI-medium 1640.
- Opnå kommercielt tilgængelig rekombinant GM-CSF eller brug GM-CSF indeholdende supernatant fra AG8.653 myelomaceller transficeret med GM-CSF-gen 20. Bestemme koncentrationen af GM-CSF i supernatanten med ELISA og tilføj hvad der svarer til 20 ng / ml til BMC medier.
- Spin ned knoglemarvsceller ved 314 xg i 5 min. Pelleten er rød, skyldes RBC'er. I BSC, opsug supernatanten under anvendelse af en steril glas Pasteur-pipette fastgjort til vakuumansugning, løsne pelleten ved at trykke, hvorefter der tilsættes 10 ml RBC lysebuffer. Vortex for at resuspendere cellerne og inkuberes i RBC lysis buffer ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 10 ml HBSS-FCS derefter spinde celler ved 314 xg i 5 min og aspirere supernatanten. Observere cellepelleten som hvid farve. Resuspender celler i ønskede volumen af BMC medier.
- Tæl resuspended-celler under anvendelse af et hæmocytometer efter farvning døde celler med 0,4% trypanblåt.
BEMÆRK: Hvis der bruges knoglemarv fra det ene ben (enkelt skinneben og lårben), resuspender i 5 ml BMC medier, tage 10 pi cellesuspension og fortyndes med 70 pi 0,4% trypanblåt, bland godt og overføre 10 pi 1/8 celle fortynding til hæmocytometeret kammeret. Tæl levedygtige celler i fire kvadranter: gennemsnittet af de fire kvadrant tællinger x fortyndingsfaktor x 10 4 = antal celler per ml. En femur og et skinneben fra ét ben vil generelt give ca. 2 - 4 x 10 7 celler efter RBC lysis. - Estimere antallet af 10 ml retter af knoglemarvskulturer nødvendige for downstream eksperimenter baseret på antallet af totale celler, der er nødvendige til eksperimenter ved afslutningen af dyrkningen.
BEMÆRK: Hver skål kræver 2 x 10 6 knoglemarvsceller ved indledende såning og udbytter 5 - 10 x 10 6 celler på dag 7.- Aliquot det totale antal celler til udpladning i et nyt rør, spin ned på 314 xg i 5 min, aspireres supernatanten, og resuspender celler ved 4 x 10 6 celler / ml i BMC medier.
- Forbered en ny steril 100 mm x 15 mm petriskål med 9,5 ml BMC medium indeholdende 200 ng af GM-CSF (rekombinant eller fra GM-CSF indeholdende supernatant). Der tilsættes 500 pi af de 4 x 10 6 celler / ml knoglemarvsceller til midten af petriskålen ved den endelige koncentration på 2 x 10 5 celler / ml i 10 ml.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en steril petriskål ikke en vævskulturskål. Også, når der tilføjes cellerne, sikre celler forbliver koncentreret i midten og minimere forstyrrelser til skålene efter podning og under medieændringer. Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Dette er dag 0 i kultur. - På dag 3 tilsættes 10 ml frisk BMC medier indeholdende 200 ng af GM-CSF til hver skål af celler. Vær omhyggelig med at minimere forstyrrelser of cellerne blev koncentreret i suspension. Samlet volumen af cellekultur nu 20 ml.
- Observere celler under lys mikroskop ved 100X forstørrelse. Observere mange ikke-adhærente celler (runde) og et par adhærente celler (flade). Celler i grupper på tre eller fire ligner kronblade af en blomst kan ses som en indikation proliferation.
- På dag 6 udfører en halv medier ændring. Fjern forsigtigt 10 ml medier i en steril 50 ml konisk rør, spin ned på 314 xg i 5 min, aspireres og kassér supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 10 ml frisk BMC medium indeholdende 20 ng / ml GM-CSF, forsigtigt vortex og tilsæt til den oprindelige celledyrkningsskål til et samlet volumen på 20 ml. Observere celler under mikroskopet.
BEMÆRK: Dag 7 kultur bør være på 70% eller mere i sammenløb med vedhængende flade celler og tætte skyer af runde ikke-klæbende celler.
3. Indsamling og forberedelse BMDC og BMDMs for flowcytometri
- <li> Hold alle buffere ved 4 ° C.
- Cellerne høstes fra dag 7 til dag 10. For at høste cellerne, første overførsel 10 ml af kultursupernatanten til en 50 ml konisk opsamlingsrør, derefter vippe skålen lodret ved ca. 30 grader og vaske skålen ved pipettering de resterende 10 ml kulturens fra toppen af skålen. Gentag denne vask 5 gange, hver gang dreje skålen med en tredjedel.
- Overfør de resterende 10 ml celler til det samme opsamlingsrøret og kassér pladen og adhærente celler.
BEMÆRK: De vasker vil fjerne ikke-klæbende og løst vedhængende celler; de flade adhærente celler er resistente over for vaskene. Typisk mellem 5 - 10 x 10 6 ikke-adhærente celler forventes fra en plade på dag 7 og 2 - 5 x 10 6 celler på dag 10, selv om Lutz et al. indberettet 10 x 10 6 celler på dag 10. De adhærerende celler normalt ikke taget. Hvis disse celler skal sammenlignes med de ikke-adhærente celler, Kan de fjernes på følgende måde. Der tilsættes 5 ml 0,7 mM EDTA i 1 x PBS, pH 7,4 til skålen efter de ikke-adhærente celler fjernes, inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter, pipette op og ned for at fjerne de adhærerende celler og samles i et separat rør. - Spin ned de indsamlede cellerne ved 314 x g i 5 min og aspirere supernatanten. Resuspender i 5 ml sterilt BMC medier ved 4 ° C, vortex forsigtigt for at blande, og tælle hjælp trypanblåt og hæmocytometer.
BEMÆRK: Hver skål vil give 5 - 10 x 10 6 ikke-adhærente celler fra en dag 7 kultur. Fra nu af, udføre alle trin ved 4 ° C. - Til flowcytometrisk analyse, overførsel 2 x 10 5 celler for hver prøve i 5 ml polystyren rundbundede rør, tilsættes 300 pi FACS buffer ved 4 ° C (1x phosphatpufret saltopløsning, 2 mM EDTA og 2% bovint serumalbumin) til hver prøve.
- Spin celler ned på 314 xg i 5 min og aspirere supernatanten. Observere en synlig hvid, uigennemsigtig pellet vedbunden af røret.
- Resuspender celler i 100 pi umærket Fc-receptor Ab at blokere Fc-receptor binding (Brug 1/10 supernatant fra 2.4G2 producerende myelomacellelinie) og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C. Derefter tilsættes 300 pi FACS buffer til hver prøve, forsigtigt vortex, derefter spinde cellerne ned ved 314 x g i 5 minutter og aspirere supernatanten.
- Resuspender celler i 100 pi CD11c-PeCy7 0.2 ug / ml, Gr1-Pacific Blue 0.25 pg / ml, MHCII-APC 0.05 ug / ml, og FL-HA ved ca. 2 ug / ml for at identificere makrofager og DC'er.
BEMÆRK: FL-HA blev fremstillet i huset ved hjælp fluorescein og hane kam hyaluronsyre-natriumsalt som tidligere beskrevet 21. - Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C for at tillade binding til celleoverfladen. Der tilsættes 300 pi FACS buffer til hver prøve, forsigtigt vortex, derefter spinde cellerne ned ved 314 x g i 5 min ved 4 ° C og aspireres supernatanten BEMÆRK:. Hvis biotinylated antistoffer anvendes i 3,8, gentag 3,8-9 med fluorescerende-streptavidin.
- Vask cellerne med en anden 300 pi af FACS buffer, forsigtigt vortex at blande og spin ned cellerne ved 314 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 200 pi FACS buffer indeholdende 0,1 - 0,2 ug pr ml propidiumiodid eller DAPI at mærke ikke-levedygtige celler. Celler er nu klar til flowcytometrisk analyse 22.
BEMÆRK: Se Resultater og figur 3 for nærmere oplysninger om befolkningerne, og hvordan cellerne blev gated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et rutediagram, der sammenfatter de vigtigste trin i denne fremgangsmåde er vist i figur 1. Densiteten og morfologi af knoglemarven kultur på forskellige tidspunkter af kulturen er vist i figur 2. På dag 1 er cellerne små og sparse men ved dag 3, der er flere celler, nogle er større og nogle er begyndt at klæbe. Efter 6 dage er der en klar vedhæftende og ikke-klæbende fraktion (figur 2A). Kulturen kan høstes fra dag 7 - 10 ud en højere procentdel af CD11c + celler til stede på dag 10. Figur 2B viser dag 7 kultur før høst, samt de separerede adhærente og ikke-adhærente cellefraktioner. Den adhærerende fraktion består af cellerne tilbage efter de lette opvaske, fjerne den ikke-klæbende fraktion. Den ikke-klæbende del er stærkt beriget med celler med en dendritisk morfologi, som kan ses mere tydeligt i den digitalt forstørret imaldre i indsatsene i figur 2b. Når den ikke-klæbende fraktion fjernes (dag 7 eller dag 10) cellerne analyseret ved flowcytometri efter mærkning med fluorescerende antistoffer mod vigtige celleoverflademarkører, som beskrevet ovenfor. Figur 3 viser repræsentative flowcytometri afbildninger af ikke-klæbende fraktion af kulturen på dag 7 og dag 10.
Til identifikation af både makrofager og udviklingslandene, gate på CD11 c + og Gr1 - celler efter første gating på størrelse og levende celler (figur 3A og B). I dag 7 kulturer, den CD11c + Gr1 - befolkning i den ikke-adhærerende cellefraktion er typisk 60 til 70% af de samlede levende celler, og dette forøges til 90% eller mere på dag 10 (figur 3B). Den CD11c + Gr1 - befolkning på dag 7 og dag 10 kan inddeles i tre hovedgrupper delmængder hjælp MHCII og FL-HA binding: MHCII mid / lav FL-HA binding høje makrofager (P1), MHCII midten FL-HA-bindende lave (P2) celler indeholdende umodne DC'er, og MHCII høj FL-HA-bindende lave modne DC'er (P3) (figur 3C og reference 18 ). FL-HA lav, MHCII lav population (P0) observeret ved dag 7 er vist at indeholde progenitorer for P1-P3-celler 18. Denne population er ikke tydelig ved dag 10 indebærer, at yderligere modning af kulturen er opstået. Dette understøttes også af den større procentdel af CD11c celler i kultur samt lidt højere procentdele af P2 og P3 DC populationer på dag 10. Figur 3D viser MerTK, anses for at være en makrofag markør, er overudtrykt på både makrofager og umodne DC-populationer (P1 og P2), men udtrykkes i en mindre grad på modne DC'er (P3 celler). Navnlig analyse af det klæbende fraktion afslører tilstedeværelsen af P0, P1 ogP2 populationer, men ikke P3 modne DC population (data ikke vist). makrofager er således til stede i de adhærente og ikke-adhærente fraktioner, men kun modne DC'er er til stede i den ikke-adhærerende fraktion.
. Figur 1: et flowdiagram, der angiver vigtige skridt i den metode Primære celler høstes fra knoglemarven, belagte og vedligeholdes i kultur i 7 - 10 dage, hvor de høstes til brug i yderligere forsøg, renset eller anvendes i FACS-analyse. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroskopisk undersøgelse af GM-CSF afledte knoglemarvsceller. EN) knoglemarven kultur på dag 1, 3 og 6 viser stigningen i celletal, ændringer i morfologi og fremkomsten af distinkte adhærente og ikke-adhærente fraktioner. B) Venstre panel viser dag 7 knoglemarv kultur og den typiske celledensitet. Det midterste panel viser dag 7 adhærente celler efter høst af den ikke-klæbende del og den højre panel viser ikke-klæbende fraktion høstes på dag 7. Inlays er digitalt forstørrede billeder af celler i denne fraktion med dendritisk morfologi. Målestokken hvid repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ Fænotype af GM-CSF Culture på dag 7 og dag 10. Ikke-klæbendeceller fra kulturen er mærket med CD11, Gr1, MHCII, FL-HA, og MerTK på dag 7 eller dag 10 og analyseret for deres fænotype ved flowcytometri. A) Celler blev først gatet på størrelse derefter levende celler. B) viser en plot af gated celler med CD11 c og Gr1 (neutrofil / monocyt markør) og identificerer CD11c + Gr1 - befolkning, der indeholder makrofager og dendritiske celler. Gating på denne population, C) viser flowcytometri plot af MHCII og FL-HA-binding, som viser adskillelsen af alveolære-lignende makrofager (P1) fra umodne DC'er (P2) og modne DC'er (P3), som beskrevet i Poon et al. 18. D) Histogrammer sammenligner MerTK udtryk mellem P1 (makrofager), P2 (umodne DC'er), og P3 populationer (modne DC'er) på dag 7 og dag 10. klik her for at se en større version af denne Figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript, tilvejebringer vi en fremgangsmåde til frembringelse af GM-CSF afledte makrofager og DC'er fra en enkelt mus knoglemarv kultur, der er tilpasset fra Lutz et al. 6. MHCII ekspression og FL-HA bindende skelner mellem umodne DC'er og makrofager i denne kultur (se figur 3C), som tidligere har været vanskeligt. Dette, sammen med en anden rapport fra Helft et al. 19, viser heterogenitet inden GM-CSF induceret BMDC kulturer, der tidligere blev anset for at være kun DC'er. Helft et al. 19 anvendes helt andre dyrkningsbetingelser til frembringelse BMDCs endnu også fandt en signifikant makrofag population. GM-CSF inducerede makrofager ligne alveolære makrofager og GM-CSF inducerede DCs ligne inflammatoriske udviklingslandene, mens FLT3 ligand suppleret BMDC kulturer producerer klassiske og plasmacytoide DCs 3,4. Forskellige DC og makrofag populationer er også observeret in vivo unwho homeostatiske og inflammatoriske tilstande, og der er megen diskussion på området, hvad definerer en DC og en makrofag 10. Dette gælder især, når det kommer til monocytderiverede inflammatoriske DC'er og dette er også relevante i denne BMC. Det er således vigtigt at anvende flere fænotypiske markører, funktionelle data og eventuelt genekspression data til at karakterisere en bestemt befolkningsgruppe. Det er også muligt, at disse in vitro DC og makrofag populationer kan yderligere underopdeles som mere funktionelle og fænotypiske markører er opdaget.
I denne metode, kan markørerne CD11c, Gr1, MHCII, og FL-HA anvendes til at skelne makrofager fra umodne og modne dendritiske celler i den ikke-klæbende del af den BMC kultur. Dette er anderledes end Helft et al. 19, der brugte markører CD11c, CD11, CD115, CD135, MerTK, og MHCII at skelne en makrofag befolkning fra modne DC'er. MerTK ekspressionsniveauerne kunne distinguish mellem makrofager (P1) og modne DC'er (P3), men ikke umodne DC'er (P2) (figur 3D). Således FL-HA og MHCII er nyttige markører til at diskriminere makrofager fra både umodne og modne DC-populationer. Disse makrofager er også funktionelt forskellige fra DC'er i denne BMC kultur og dette vises mere detaljeret andetsteds 18. Kort fortalt efter LPS stimulering de BMC makrofager producerer forskellige cytokiner end modne DC'er og ikke aktiverer naive T-celler 18. Disse makrofager også ligner alveolære makrofager, både fænotypisk og funktionelt som både binder FL-HA og udtrykke CD11c, MerTK, CD200R, CD206 og F4 / 80 og efter LPS stimulering producere TNF-α endnu ikke er i stand til at aktivere naive T-celler 18. Men der er også forskelle: BMC makrofager er CD11 + og har lavere niveauer af Siglec F sammenlignet med ex-vivo alveolære makrofager, hvilket tyder disse celler ligner hinanden, men ikke identificeretcal til alveolære makrofager.
Der er flere vigtige skridt til at sikre succes i denne protokol. Det er vigtigt at opretholde sterilitet udsætter knoglemarven fremefter. Når man bevæger sig ind og ud af BSC, spray behandskede hænder og objekter med 70% ethanol. Selv om det er nyttigt at skylle værktøjer i 70% ethanol til at sterilisere, ethanol er giftigt for knoglemarvsceller, så luft-tørre redskaber og sikre ethanol er fordampet før at bringe knogler eller celler i kontakt med dem. Desuden undgå at kontakte muse væv eller celler med ikke-sterilt udstyr eller hænder under knoglemarven høst. Selvom penicillin og streptomycin tilskud er tilvejebragt i medierne, kan uforsigtig håndtering af cellerne føre til gær eller fungal kontaminering. Eftersom immunceller med fagocytisk aktivitet genereres i denne kultur, mindre forurening kan ikke detekteres ved blot at iagttage cellekulturen mikroskopisk, således er det vigtigt at identificere than underskriver for forurening. For eksempel kan celleantal reduceres, og ekspressionen af aktiveringen af celler markører, såsom CD40 og CD86 kan øges ved analyse ved flowcytometri. Media farve kan også blive gule afspejler en pH-ændring på grund af forurening. Når forurening forekommer, BMC kultur er ubrugelig. For at opretholde eksperimentel sammenhæng, er det vigtigt at frembringe en enkelt cellesuspension fra knoglemarven ved hvirvelblanding og opnå en nøjagtig celletal at oprette de BMC kulturer. Også, hvis nogen bindevæv fra knoglen ender i enkelt cellesuspension, filtreres gennem et sterilt 70 mikron filter for at fjerne det. Typiske celleudbytter for én plade af den ikke-klæbende del på dag 7 er mellem 5 - 10 x 10 6 celler. Cell numre er normalt en god indikation af, at protokollen fungerer godt. Med denne procedure, vi normalt får mellem 2 - 5, x 10 6 celler på dag 10, mens Lutz rapporter 10 x 10 6 celler. Vi udfører RBC lysis på the indledende knoglemarvsceller Protokollen af Lutz et al. ikke og så dette trin kan være frivillig. Variationer i procent af CD11c celler såvel som tal, og de andele makrofager og DC'er kan opstå fra forskellige kilder eller partier af FCS og så er det afgørende at afprøve nye partier af FCS på BMC kulturer til konsistente eksperimentelle resultater. GM-CSF-koncentration blev varieret fra 5 ng / ml til 40 ng / ml, og dette påvirkede ikke signifikant cellen udbytte. Celledensitet kan også påvirke modningen af kulturen. F.eks Helft et al. podet 1 x 10 7 celler i 4 ml medium, der fremstillede en større procent af celler med høj MHCII ekspression 19. Tidspunktet hvor celler høstes kan også påvirke procentdelen af bestande, der findes i den ikke-klæbende fraktion. Celler er typisk indsamlet mellem dag 7 - 10 25-27, men nogle undersøgelser indsamle BMC'er på dag 6 19,23,24. Hvis der er behov for flere celler, kultur BMC'eri større 150 mm x 15 mm petriskåle i 40 ml ved den samme tæthed. I dette tilfælde et medie ændring halv volumen sker på både dag 3 og dag 6 (dvs. 20 ml medium fjernet, celler spundet ned og erstattet med frisk 20 ml medium suppleret med 20 ng / ml rGM-CSF). Disse plader typisk generere 3 - 6 x 10 7 celler pr skål på dag 7. FL-HA er en vigtig reagens, sammen med MHCII, at skelne makrofager fra umodne og modne DC'er i BMC kultur. Således når det er gjort, titrere FL-HA til brug på celler er kendt for at konstitutivt binde HA såsom alveolære makrofager 18 eller BW5147 T-celler og bekræfte sin specificitet ved hjælp af enten en HA-blokerende CD44-antistof (KM-81, kommercielt tilgængelig), umærket HA eller en CD44-deficient celle. CD11c - GR1 + celler i kultur kan fungere som en intern kontrol for ikke HA-bindende celler, og en fluorescens minus én kontrol (FMO) eller CD44 mangelfulde BMC kulturer er stærkt anbefales til nøjagtig setting af FL-HA bindende gate.
Selv om der kan udføres eksperimenter under anvendelse af en heterogen kultur, er det tilrådeligt at berige for DC eller makrofag population ved anvendelse af enten fluorescensaktiveret cellesortering eller antistofcoatede magnetiske perler 18 baseret på ekspressionen af CD11c, Gr1, MHCII, og HA-binding. Mulige forsøg, indbefatter stimulering med Toll-lignende receptoragonister såsom LPS at måle aktivering og cytokinproduktion, T celleaktiveringsassays, eller yderligere karakterisering ved flowcytometri. For eksempel, efter 8 eller 24 timer af stimulering, flowcytometri kan anvendes til at måle intracellulær farvning for cytokiner og / eller overflade mærkning af co-stimulerende molekyler såsom CD40 og CD86, som beskrevet i 18. Intracellulære cytokin etikettering kræver forbehandling af cellerne med Brefeldin A, som forhindrer sekretion og tillader cytokinet at opbygge inde i cellen. For T celleaktiveringsassays involverer loading af et antigen, såsom OVA peptidet ved en antigen-præsenterende celle, rensede makrofager baseret på MHCII og HA binding vil ikke aktivere T-celler, mens umodne og modne DC'er vil 18. Det skal bemærkes, at sorteringsproceduren alene kan aktivere de dendritiske celler i et vist omfang, hvilket gør det vigtigt at inkludere negative kontroller i alle eksperimenter.
Som med enhver in vitro-metode, der er fordele og ulemper sammenlignet med anvendelse af in vivo eller ex vivo-celler. Ulempen er, at in vitro-afledte celler kan ikke nøjagtigt efterligner in vivo-celler, men de har den fordel, at de kan dannes i tilstrækkeligt antal til at tillade funktionel og biokemisk analyse, hvilket er ofte ikke muligt med ex-vivo-celler. Denne metode til makrofag og DC identifikation vil tillade fremtidig forskning for at opnå mere homogene cellepopulationer fra en kultur med tidligere underappreciated heterogeneity. Som oprensede makrofager fra denne GM-CSF kultur ligner alveolære makrofager fra lungerne 18, det giver en bekvem kilde for alveolære-lignende makrofager til in vitro-analyse. For eksempel kan disse HA-bindende makrofager anvendes til at screene for lægemidler, der modificerer alveolær makrofag funktion og at undersøge mekanismerne for Mycobacterium tuberculosis-infektion og modstand. I betragtning af den nylige opdagelse, at GM-CSF og M-CSF knoglemarv-afledte makrofager transplantation kan lindre pulmonal proteinosis i mus 28,29, kan denne metode til at identificere makrofager fra GM-CSF-kulturer bidrage til at øge effektiviteten af denne foreslåede terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) og naturvidenskab og teknik Råd Canada (NSERC). NSERC støttede også sommer stipendier til YD og AA YD understøttes af University of British Columbia (UBC) med en 4-års stipendium award, er AA støttes af CIHR med en ph.d.-studerende kandidatuddannelse award (CGS-M). Vi takker Calvin Roskelley for assistance med mikroskopet bruges til at generere billederne i figur 2. Vi anerkender også støtte fra UBC Animal og flowcytometri faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
