Abstract
Etiologi og konsekvensene av menneskelig eksponering for miljø patogener er av stor bekymring over hele verden, og dermed vil evnen til å vurdere eksponering og infeksjoner ved bruk av kostnadseffektive, high-throughput tilnærminger være uunnværlig. Dette manuskriptet beskriver utvikling og analyse av en kule-baserte multipleks immunoassay stand til å måle nærværet av antistoffer i humant spytt til flere patogener samtidig. Spytt er spesielt attraktivt i denne anvendelse fordi den er ikke-invasiv, billigere og enklere å samle enn serum. Antigener fra miljøet patogener ble koblet til karboksylerte mikrosfærer (perler) og brukes til å måle antistoffer i meget små volumer av human spyttprøver ved hjelp av en vulst basert, løsning-fase-analysen. Perler ble kombinert med antigener fra Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 og G II.4) og hepatitt A virus. For å sikre at antigenene var tilstrekkelig koblet tilkulene, kobling ble bekreftet ved bruk av artsspesifikke, animalske primære fangst-antistoffer, etterfulgt av inkubasjon med biotinylerte anti-arter sekundære deteksjon-antistoffer og streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE). Som en kontroll for å måle ikke-spesifikk binding, ble en perle sett behandlet identisk med de andre, bortsett fra at det ikke ble koblet til en hvilken som helst antigen. De antigen-koblet og kontroll perler ble deretter inkubert med fremadrettet oppsamlede humane spyttprøver, målt på en høy gjennomstrømning analysator basert på prinsippene om flowcytometri, og nærværet av antistoffer mot hvert antigen ble målt i Median fluorescensintensitet enheter (MFI) . Denne multiplex immunoassay har en rekke fordeler, blant annet mer data med mindre prøven; reduserte kostnader og arbeid; og evne til å tilpasse analysen til mange mål av interesse. Resultater indikerer at spytt multipleks immunoassay kan være i stand til å identifisere tidligere eksponeringer og infeksjoner, som kan være especially nyttig i overvåking studier som involverer store befolkningsgrupper.
Introduction
Åtti-åtte prosent av diaré-relaterte sykdom på verdensbasis er forbundet med menneskelig eksponering for forurenset vann, utrygg mat, og dårlig hygiene / hygiene, forårsaker om lag 1,5 millioner dødsfall, de fleste av dem er barn 1. Dette er en viktig årsak til bekymring for offentlige helsemyndigheter og politikere. I et forsøk på å undersøke eksponeringer og sykdommer forbundet med vannbåren og andre miljø patogener, har vi utviklet en multiplex immunologisk å måle antistoffer i humane prøver 2-4. Denne fremgangsmåten kan anvendes på epidemiologiske studier for å bestemme human eksponering for disse patogener og for å bedre definere immunoprevalence og innfallende infeksjoner.
Spytt holder betydelige løftet som et alternativ til serum for human biomarkør forskning. Blant fordelene med å bruke spytt er den ikke-invasivitet og enkel prøvetaking, lav pris, og prøvene kan lett hentes fra barn 5-7 </ Sup>. Serum og spyttprøver har blitt studert for antistoffer mot H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatittvirus A og C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue virus 16, humant immunsviktvirus (HIV) 17, og Escherichia coli O157: H7 18.
En multipleks immunoassay tillater analyse av multiple analytter samtidig innenfor en enkelt prøvevolum og i løpet av en enkelt syklus eller løp. Multipleksede antigener fra C. jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitt A virus, og to noroviruses ble brukt til å måle menneskelig spytt IgG 2-4 og IgA 3,4 og plasma IgG 2,3 antistoffresponser mot disse patogener ved hjelp av enperle-baserte multipleksing immunoassay. Når den brukes sammen med epidemiologiske studier av eksponering for mikrober i vann, jord og mat, kan den typen av analysen beskrevet i denne studien gi verdifull informasjon for å forbedre forståelsen av infeksjoner forårsaket av miljø patogener. Videre kan spytt antistoff-data oppnådd fra slike undersøkelser anvendes for å forbedre risikovurderinger modeller 19-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkjenning ble innhentet fra Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) for innsamling av stimulert crevikulære spyttprøver fra badestrand på Boqueron Beach, Puerto Rico, som en del av USA Environmental Protection Agency (USEPA) National Epidemiologiske og Environmental Assessment of Recreational (neear) Vann Study 23 for å vurdere svømme forbundet eksponeringer og sykdommer. Forsøkspersonene gitt informert samtykke og ble instruert om bruken av spytt samling enheten ved trente USEPA entreprenører. De spyttprøver ble transportert på is og, ved mottak, ble de sentrifugert og lagret ved -80 ° C som beskrevet fire.
1. Bead Activation
- Resuspender perle sett bestander av virvling og sonicating for 20 sek og overføring ca 5,0 x 10 6 av aksje perler (400 mikroliter) til mikrosentrifugerør.
Merk: THan perler blir tilført ved en konsentrasjon på 12,5 x 10 6 perler / ml. - Pellet lagerkuler ved sentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelle perlene i 100 pl destillert vann (dH 2 O) av vortex og sonikering i 20 sekunder. Gjenta trinn 1.2.
- Fjern supernatanten og resuspender vaskede kuler i 80 pl 100 mM monobasisk natriumfosfat, pH 6,2 ved vortex og sonikering i 20 sekunder.
- Umiddelbart før bruk, få en 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) løsning ved å tilsette 200 ul dH 2 O til 10 mg Sulfo-NHS alikvot. Bland ved vortex.
- Tilsett 10 ul av 50 mg / ml Sulfo-NHS til kulene. Bland ved vortex.
- Umiddelbart før bruk, få en 50 mg / ml 1-etyl [3dimethylaminopropyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) løsning ved å tilsette 200 pl destillert vann (dH 2 O) til 10 mg EDC aliquot. Bland ved vortex.
- Tilsett 10 ul 50mg / ml oppløsning EDC til kulene. Bland ved vortex. Inkuber perler i 20 minutter ved romtemperatur, i mørke, under omrøring ved virvel ved 10 min intervaller. Pellet aktiverte perler av mikrosentrifugering ved 10 000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender perlene i 250 ul 50 mM 2- [N -Morpholino] etansulfonsyre (MES), pH 5,0 ved vortex og sonikering i 20 sekunder.
- Pellet aktiverte perler av mikrosentrifugering ved 10 000 xg i 2 min.
- Gjenta trinn 1,9 og 1,10.
Merk: Dette gir totalt to vasker med 50 mM MES, pH 5,0. - Resuspender perler i 100 ul av 50 mM MES, pH 5,0 ved vortex og sonikering i 20 sekunder.
2. Perlene Coupling
- Par antigenene til perlesett med de konsentrasjoner som vist i tabell 1.
- Legg hvert antigen som er aktive til kulene og bringe det totale volum til 500 pl i 50 mM MES, pH 5,0. Bland antigener end perler av Vortex.
- Inkuber antigener og perler i 2 timer under omrøring ved rotasjon (~ 15 rpm) ved romtemperatur i mørket. Pellet kombinert perler av mikrosentrifugering ved 10 000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender perlene i 500 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) -bovine serumalbumin (BSA) -polyoxyethylenesorbitan-monolaurat (Tween-20) natrium-azid (PBS-TBN) pH 7,4 ved vortex og ultralydbehandling. Pellet perlene ved mikrosentrifugering ved 10.000 xg i 2 minutter og fjerne supernatanten.
Forsiktig: Natriumazid er en akutt giftige kjemikalier. Det er dødelig ved svelging eller kommer i kontakt med hud. Unngå innånding av støv / røyk / gass / tåke / damp eller spray. Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU) når du håndterer og kast i samsvar med aktuelle lover. - Resuspendere kulene i 1 ml PBS-TBN ved vortex og sonikering i 20 sekunder.
- Pellet perlene ved mikrosentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Gjenta trinn 2,5 og 2,6.
Merk: Dette gir totalt to vasker med PBS-TBN. - Resuspender de sammenkoblede og vaskede kuler i 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% azid, pH 7,4. Oppbevar koplet perlene i en 2-8 ° C kjøleskap i mørket.
3. Bead Count
- Forbered en 1:10 fortynning av kombinert perler i vann eller PBS buffer.
- Belastning 10 ul av vulsten fortynning bort på et hemocytometer ved prøve innledningen punktet.
- Telle perler sett på ett av de 4 x 4 hjørne nett. Beregn det totale antall koblede kuler ved anvendelse av følgende formel: Antall (1 hjørne av 4 x 4 gitter) x (1 x 10 4) x (fortynningsfaktor) x resuspensjon volum i ml.
4. Bekreftelse på Antigen Coupling
- Resuspender lager blanding av perler koblet til antigener av interesse ved vortex og ultralydbehandling i 20 sekunder.
- Forbered en arbeider perle blanding ved å fortynne kombinert perle aksjer til en endeligkonsentrasjon på 100 kuler / mikroliter av hver unike perle sett i PBS-1% BSA-buffer (PBS-1% BSA, pH 7,4).
- Tilberede minst 7 to ganger serielle fortynninger av anti-art IgG primært antistoff i henhold til produsentens anbefalinger i 96-brønns rundbunnet plate med PBS-1% BSA-buffer.
- Pre-våte en separat 8-brønns-kolonne (8 rader) av en 96-brønns filterbunnplate for hvert antigen kopling bekreftelsestest med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Tilsett 50 mL av arbeids perle blanding (antigen-coupled perler) til pre-våte brønner.
- Tilsett 50 ul antistoff fortynninger til rader 1-7 i hver kolonne i 96-brønns filterplate og 50 ul av PBS-1% BSA-buffer for å ro 8 i stedet for fortynnet antistoff for å tjene som bakgrunnsbrønner. Bland med en multikanal pipette ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Utfør den samme prosedyren for hvert antigen-coupled perle satt til å bli bekreftet.
- Dekk og tillate å inkuberes i mørke ved romtemperaturerature i 1 time på en mikroplaterister ved 500 omdreininger pr. Fjern supernatanten ved vakuum.
- Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta 1x. Resuspender perler i 50 ul PBS-1% BSA med en multikanal pipette.
- Fortynn biotinylerte anti-artsspesifikt IgG sekundært antistoff påvisning til 16 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilsett 50 ul fortynnet, sekundært antistoff til hver brønn ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
- Dekk filterplaten og tillate å inkuberes i mørke ved romtemperatur i 30 minutter på en plateryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta vask 1x.
- Resuspender perler i 50 ul PBS-1% BSA med en multikanal pipette.
- Fortynn streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE) til 24 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilsett 50 mL av reporter til hver brønn og bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
- Ci løpet av filterplaten og la det inkuberes i mørke ved romtemperatur i 30 minutter på en plateryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta vask 1x.
- Resuspender perler i 100 ul PBS-1% BSA og analysere 50 ul ved hjelp av analysatoren 29.
Merk: Resultater av vulsten baserte multipleks immunoassay er målt i Median fluorescensintensitet (MFI). Se alltid til den nyeste versjonen av programvaren manuell, hvis tilgjengelig for å unngå feil.
5. Spytt Multiplex Immunoassay
- Fjerne spytt fra -80 ° C fryseren og la det tine ved romtemperatur.
- Resuspender antigen kombinert kule bestander av virvelen og sonikering i 20 sekunder.
- Forberede en arbeids perle-blandingen ved å fortynne de sammenkoblede perle aksjer til en sluttkonsentrasjon på 100 kuler / mikroliter av hver unike perle sett i PBS-1% BSA-buffer.
- Forbered en 1: 4 fortynning av spytt wed PBS-1% BSA-buffer i en 96-brønners, dyp brønn plate.
- Pre-våt filterplate med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum.
- Tilsett 50 pl av en arbeids perle-blandingen, og et likt volum av fortynnet spytt til 95 brønner av 96-brønners filterplater for en 1: 8 endelig fortynning. Bland reaksjoner med en flerkanals pipetten. Til den ene styre godt, tilsett 50 pl antigen-koblede perler pluss 50 ul av PBS-1% BSA-buffer (som en erstatning for spytt).
- Dekk og tillate å inkuberes i mørke ved romtemperatur i 1 time på en mikroplaterister ved 500 omdreininger pr. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta vask 1x.
- Resuspender perler i 50 ul PBS-1% BSA med en multikanal pipette.
- Fortynn biotinylert geite anti-human IgG sekundært antistoff deteksjon til 16 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilsett 50 ul fortynnet, sekundært antistoff til hver brønn og bland innholdet meden flerkanals pipetten.
- Dekk filterplaten og tillate å inkuberes i mørke ved romtemperatur i 30 minutter på en plateryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta vask 1x.
- Resuspender perler i 50 ul PBS-1% BSA med en multikanal pipette.
- Fortynn streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE) til 24 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilsett 50 mL reporter til hver brønn og blandes med en multikanal pipette.
- Dekk filterplaten og tillate å inkuberes i mørke ved romtemperatur i 30 minutter på en plateryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brønnene med 100 ul vaskebuffer og supernatanten fjernes ved hjelp av vakuum. Gjenta vask 1x.
- Resuspender perler i 100 ul PBS-1% BSA og analysere 50 ul ved hjelp av analysatoren 29.
Note: Resultatene av multipleks immunoassay er målt i Median fluorescensintensitet (MFI) enheter. Se alltidden nyeste versjonen av programvaren manuell, hvis tilgjengelig for å unngå feil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Og en unik perlesett ble anvendt som en kontroll for å måle ikke-spesifikk binding og prøve til prøve variabilitet. Disse perler ble behandlet identisk til de antigen kombinert perler med unntak av at de ikke ble inkubert med hvilken som helst antigen i koblingstrinnet. MFI-verdier> 500 oppnådd fra kontrollperlene inkubert med alle spyttprøver ble fjernet fra ytterligere analyser på grunn av mistanke om forurensning fra serum og de resterende responser ble log fordelt. Spytt kan være forurenset med serum hvis tannkjøttet blir gnidd altfor kraftig med svampen er festet til oppsamlingsinnretningen, eller hvis den studiedeltakeren har periodontal sykdom. Loggen forvandlet MFI data ble brukt for å beregne en immunopositive cut-off point of 505 MFI basert på gjennomsnittet pluss 3 standardavvik logg MFI verdier. I tillegg ble det antigen-koblet kuler tilsatt til bestemte brønner som ble behandlet som testbrønner i hvert måte bortsett dilUted spytt ble erstattet med PBS-1% BSA for å evaluere bakgrunnsfluorescens og kryss-reaktivitet. MFI verdiene oppnådd i disse bakgrunns brønnene ble trukket fra MFI verdiene fra hver antigen-coupled perle sett for hver spyttprøve.
Perlene kopling ble bekreftet ved hjelp av animalske artsspesifikke primærdeteksjons antistoffer spesifikke for hvert antigen. For å sikre at antigenet er koplet kulene var i stand til å nærme seg det dynamiske området av analysen, vi definert korrekt kopling som en MFI ≥18,000, observasjon av dose-respons og kryss-reaktivitet mellom primære antistoffer og ikke-mål på <10%, som beskrevet 2 . Representative koblings bekreftelser for C. jejuni og T. gondii av antigenene i analysen er vist i figur 1.
Basert på cut-off point etablert (505 MFI), den immunoprevalence hastighets for prøvene (n = 2078) varierte fra ca 2% (n = 41) for T. gondii til nesten 50% (n = 1009) for norovirus GI.1 (figur 2). Dataene indikerer at den immunoprevalence hastigheten ble høyest for noroviruses fulgt av hepatitt A-virus og H. pylori.
Mens 32% (n = 672) av prøvene ble immunonegative for alle patogener i analysen, 68% (n = 1406) var immunopositive til en eller flere patogener. Figur 3 viser fordelingen av immunopositivity til ett eller flere av patogener.
Figur 1: Kobling bekreftelse analyser for to av de organismer i multipleks immunoassay Kobling bekreftelse ble utført for alle av antigenene og diagrammer for C.. jejuni og T. gondii i denne figuren er Reprerepresentanten av koblings bekreftelser for antigenene i multipleks immunoassay. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Immunoprevalence til spesifikke patogener Immunoprevalence til bestemte patogener i multipleks immunoassay varierte fra omtrent 2% til T. gondii til nesten 50% for norovirus GI.1. Antistoffer mot norovirus antigener ble oftere observert fulgt av HAV (hepatitt A virus) og H. pylori. T. gondii og C. jejuni antistoffer dukket sjeldnere i spyttprøver analysert. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Fig. 3: Sammensetning av immunopositivity til flere patogener samtidig Multipleks immunoassay tillater analyse av immunopositivity til flere patogener samtidig i en 50 pl prøvevolum. Nesten en tredjedel av spyttprøver analysert var immunonegative for antistoffer mot alle antigenene i kinoen. Omtrent 31% av prøvene ble immunopositive for ett antigen, mens en fjerdedel var positive til to antigener. 9,4% var immunopositive til tre antigener. 3% var positive til fire eller flere antigener samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| antigen | Bead Set | kobling buffer | Ag Konsentrasjon (mikrogram) | # Perler i en hjørne | # Perler / mikroliter | Vol. 100 B / ul for 4 ml (pl) |
| C. jejuni | 8 | MES 5.0 | 50 | 64 | 6400 | 94 |
| H. pylori | 33 | MES 5.0 | 25 | 71 | 7100 | 85 |
| Hepatitt A-virus | 42 | MES 5.0 | 100 | 91 | 9100 | 66 |
| T. gondii | 30 | MES 5.0 | 25 | 85 | 8500 | 71 |
| Norovirus GII.4 | 55 | MES 5.0 | 5 | 72 | 7200 | 83 |
| Norovirus GI.1 | 67 | MES 5.0 | 5 | 63 | 6300 | 95 |
| frikoblet | 80 | MES 5.0 | 60 | 6000 | 100 | |
| Totalt volum av perler (pl) | 594 | |||||
| Totalt volum av buffer nødvendig (il) | 3406 | |||||
Tabell 1:. Arbeide perle mix for multipleks immunoassay Etter kobling og bekreftelse ble fullført, en mester blanding bestående av hver perle sett ble framstilt som vist. Hoved blanding ble fordelt mellom enll av brønnene i 96-brønners plate. Alle brønnene ble inkubert med spytt med unntak av en bakgrunnskontroll brønn som inneholdt bare perler og PBS-1% BSA-buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse resultatene indikerer at multipleks-immunoassay-metoden er nyttig for å skille mellom spyttprøver, som er immunopositive eller immunonegative. For å bestemme immunopositivity, ble en eneste cut-off point utviklet ved å beregne middelverdien pluss tre standardavvik logg forvandlet MFI reaksjoner fra kontroll koblede perler testet med alle de spyttprøver. Cut-off point gis muligheten til å vurdere eksponering og immunoprevalence til enten en enkelt eller flere patogener. Dette diskriminerende makt kan være nyttig i befolkningsstudier for å undersøke helserisiko forbundet med eksponering for miljømessige og andre patogener.
Det finnes flere andre metoder som kan brukes for å bestemme et skjæringspunkt, avhengig av fordelingen av MFI,-koblede kontroller og hvilke spørsmål undersøkelsen er utformet for å svare. Noen eksempler for å bestemme cut-offs inkluderer endelig blandet modellering 24-26, mener pluss 3standardavvik for responser til kontroller, betyr pluss 2 standardavvik for responser til kontroller og tre ganger den midlere av responser til kontroller 27,28. For enkle screenings, kan mindre strenge kriterier brukes, men for epidemiologiske studier, kan det være mer hensiktsmessig å ansette en strengere definisjon for å redusere sannsynligheten for å rapportere falske positiver. Vår første søknaden er å se på immunoconversion og immunoprevalence mellom svømmere og ikke-svømmere. I denne studien ble de koblede styre MFI ikke normalfordelt, og resultatene ble log transformert.
Fordeler til å utføre en kule-baserte multipleks immunoassay omfatter bruk av meget lave prøvevolumer, reduksjon av tid og arbeid, og evnen til å måle responser for opptil 500 analytter samtidig, mens det krever en minimal mengde av reagenser. I motsetning til tradisjonelle metoder for å vurdere antistoffnivåer som indikerer eksponering og / eller infeksjon (f.eks
Begrensninger av en multipleks immunoassay inkludere behovet for strenge optimalisering for å bestemme de optimale konsentrasjoner av primær-fangst og sekundære gjenkjennings antistoffer, antigener og reporter. Kryssreaksjoner er også et stort problem i immunanalyser som antistoffer mot et bestemt antigen kan kryssreagere med antigener fra andre organismer og dermed føre til falske positive resultater. Optimalisering, ble kryss-reaktivitet og ikke-spesifikk binding adressert tidligere 2-4. Suksessen til en slik analyse er i stor grad avhengig av evnen til å oppnå svært immunogene antigener samt spesifikke Antibodør til disse antigener for bruk i kulekoblings og kobling bekreftelsestrinnene. En annen begrensning er den begrensede tilgjengeligheten av preget (diagnostisk positive og negative) prøver å validere analyser.
Det finnes en rekke kritiske trinnene i protokollen. Disse inkluderer: å sikre antigener som vil bli koplet til kulene ikke inneholder fremmede proteiner, azid, glycin, tris eller eventuelle primære aminer. Hvis noen av disse midlene finnes i antigenpreparat, bør de fjernes ved hjelp av dialyse eller kromatografi. Det anbefales at man skal begynne med 5 ug antigen pr 5 millioner kuler og titrere for å finne den optimale konsentrasjon. Velg den optimale deteksjonsantistoff konsentrasjon som gir best sensitivitet og dynamisk område. Husk at signalene har en tendens til å avta som antigen og deteksjon antistoffkonsentrasjoner økning (krok effekt). Hvis for eksempel signalet avtar som antigen-konsentrasjonen øker deretter detektereion-antistoff kan være begrensende. Derimot, hvis signalene avta som deteksjonsantistoff øker deretter reporter (SAPE) kan være begrensende. Sjekk multiplex for kryssreaktivitet ved å kombinere den optimale koblingen for hvert protein (5000 av hver perle satt per brønn). Test multipleksede perle sett ved å kombinere med den optimale deteksjonsantistoff beløp. Optimal reporteren og lage en standardkurve av antigenet ved å teste hver enkelt antigen individuelt.
Feilsøking en multiplex immunoassay for å forbedre følsomheten og øke median fluorescerende signal er kritisk viktig. For å forbedre følsomheten, redusere enten mengden av antigen koblet til kulene eller deteksjonen antistoffkonsentrasjonen. Anvendelse av en høyere affinitet antistoff for fangst og / eller deteksjon kan også forbedre følsomheten. Økning av mengden av antigen koblet til kulene kan øke median fluorescerende signal. En studie viste at pre-inkubasjon serumprøver med polyvinylalalkoholdispergeringsmiddel pluss polyvinylpyrrolidon (polyvinylklorid) buffer er i stand til å undertrykke ikke-spesifikk binding i serologiske analyser ved anvendelse av kulebaserte multipleks-assay 30 slik som den ene som vi beskriver her. Men en annen studie av våre samarbeidspartnere fant ingen signifikant effekt mellom PBS-BSA og polyvinylklorid buffere. De konkluderte videre at på grunn av den høyere viskositeten av polyvinylklorid buffer, det skapt problemer med vulst anskaffelse i analysatoren og dannet skum i mikroplate brønnene 3.
Som konklusjon, har vi presentert en metode som er i stand til å måle nærværet av human spytt IgG-antistoffer mot flere patogener samtidig i et meget lite prøvevolum. I fremtiden vil denne analysen anvendes for å påvise tilstedeværelse av spytt antistoffer assosiert med svømme relatert eksponeringer eller infeksjoner, og for å bidra til å informere risikovurderinger modeller. I tillegg kan analysen benyttes for å måle antistoffer forbundet med luftbåren og matbårne exposures, bestemme hendelses infeksjoner eller immunoconversions og gi kritisk immunologiske informasjon til epidemiologer gjennomføre spørreskjemaet-type befolkningsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
The Environmental Protection Agency gjennom sitt Office of Research and Development finansiert og ledet forskningen beskrevet her. Det har blitt utsatt for byråets administrativ overprøving og godkjent for publisering. Omtale av varemerker eller kommersielle produkter innebærer ingen godkjennelse eller anbefaling til bruk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori: lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni: heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Consumables | |||
| 1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D.
- Mandel, I.
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
