Experimentele infectie met<em> Listeria monocytogenes</em> Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses
Summary
Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.
Abstract
L. monocytogenes is een gram-positieve bacterie die een oorzaak van voedsel overgedragen ziekte bij mensen. Experimentele infectie van muizen met deze ziekteverwekker zeer informatief over de rol van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen en specifieke cytokinen in gastheer immuniteit tegen intracellulaire pathogenen zijn. Productie van IFN-γ door aangeboren cellen tijdens subletale infectie met L. monocytogenes is belangrijk voor het activeren van macrofagen en snelle bestrijding van het pathogeen 1-3. Bovendien, IFN-γ productie door adaptieve geheugen lymfocyten is belangrijk voor het vullen van de activering van het aangeboren cellen na 4 herinfectie. L. monocytogenes infectie model vormt dus een groot hulpmiddel voor het onderzoeken of er nieuwe therapieën die zijn ontworpen om IFN-γ verhogen van invloed zijn op IFN-γ responsen in vivo en zijn productieve biologische effecten zoals het verhogen van bacteriële verwijdering en overleving verbeteren muis vaninfectie. Hier beschreven is een eenvoudig protocol voor hoe intraperitoneale infectie van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van L. monocytogenes te voeren en IFN-γ productie door NK-cellen, NKT-cellen en adaptieve lymfocyten door flowcytometrie gemeten. Bovendien worden procedures beschreven: (1) groeien en voorbereiden van de bacteriën voor inoculatie (2) meten bacteriële verontreiniging in de milt en lever, en (3) overleving maatregel dier eindpunten. Representatieve gegevens worden ook verschaft om te illustreren hoe deze infectie model kan worden gebruikt om het effect van specifieke middelen die IFN-γ reacties op L. monocytogenes en overleving van muizen uit deze infectie te testen.
Introduction
IFN-γ is een cytokine die cruciaal is voor het mediëren van immuniteit tegen intracellulaire pathogenen en voor het regelen tumorgroei 5. Het belang van deze cytokine in bacteriële resistentie blijkt uit de observatie dat de mens met mutaties in de IFN-γ signaalweg zijn zeer gevoelig voor infectie met mycobacteriën en Salmonella 6. Evenzo muizen die zowel IFN-γ of IFN-γ receptor vertonen defecten in weerstand tegen mycobacteriën 7-9 en andere intracellulaire pathogenen waaronder L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13 en 11 bepaalde virussen. Naast bestrijding pathogenen, IFN-γ speelt een cruciale rol in gastheer-afweer tegen tumoren 14. Hoewel hogere productie van IFN-γ gunstig in verband met infectie of kanker is langdurige productie van dit cytokine verbonden to de ontwikkeling van systemische auto-immuniteit 15-17 en de versnelling van diabetes type I in de niet-obese diabetische muismodel 18.
De belangrijkste bronnen van IFN-γ omvatten NK-cellen, NKT-cellen, γδ T-cellen, T helper 1 (Th1) cellen en cytotoxische T-lymfocyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ verhoogt zowel aangeboren als adaptieve immuniteit door: (1) opreguleren major histocompatibility complex (MHC) klasse I en II expressie, (2) het verhogen van de expressie van co-stimulatoire moleculen op antigeen presenterende cellen, (3) verbetering macrofaag fagocytose en de productie van pro-inflammatoire cytokines en microbiële factoren (bijvoorbeeld stikstofoxide en reactieve zuurstofsoorten), (4) het bevorderen van de differentiatie van naïeve CD4 + T-cellen in Th1 effectorcellen, (5) het bevorderen antilichaamklasse omschakeling immunoglobuline ( ig) 2a en IgG3 (in muizen), (6) het induceren van de productie van chemokinen immuuncellen rekruteren naar sites infection, en (7) verbetering van NK-cellen en CTL-reacties 5,19. Gezien het grote belang van IFN-γ in de gastheer respons op pathogenen en tumoren is recombinant IFN-γ getest voor de behandeling van verschillende infecties en maligniteiten (besproken in 19). Vanwege systemische toediening van IFN-γ of Th1 bevorderen cytokine interleukine-12 (IL-12) is geassocieerd met bijwerkingen en dosis-gerelateerde toxiciteit 19,21 is er belangstelling voor de ontwikkeling van alternatieve strategieën voor IFN-γ-productie door verhogen immuuncellen. Ontwikkeling van nieuwe biologische middelen en kleine moleculen nodig vivo screening hulpmiddelen om te testen of dergelijke middelen verhogen IFN-γ productie tijdens een immuunrespons en of dit neer zinvolle biologische effecten, zoals toename in overleving van dieren.
Experimentele infectie van muizen met de gram-positieve bacterie L. monocytogenes is een instrumentale model geweestontcijferen van de rol van IFN-γ in gastheer-immuniteit tegen intracellulaire pathogenen 1,22. Infectie van muizen met het pathogeen intraveneus of intraperitoneaal (ip) leidt tot de snelle verspreiding van de bacteriën aan de milt en lever, waar ze raken geïnternaliseerd door macrofagen en hepatocyten met piek bacteriële belasting in de milt die tussen 3 en 4 dagen na de infectie 1,3,22. Productie van IFN-γ NK-cellen is belangrijk voor macrofaagactivering en vroege resistentie tegen het pathogeen 3; echter bij hoge infectieuze doses productie van IFN-γ kan ook schadelijk pathogeen speling 23 zijn. NKT cellen zijn ook een bron van IFN-γ in de milt en lever tijdens de vroege beheersing van pathogenen 2,24 en deze productie is aangetoond dat amplificeren IFN-γ productie door andere celtypen, waaronder NK-cellen 2. Anderzijds, later werkende adaptieve T-lymfocyten, CD8 + T-cellen in partiname op, zijn belangrijk voor het bemiddelen van de goedkeuring van de ziekteverwekker en bescherming tegen herinfectie 1,4,22.
Deze infectie model voor onderzoekers om een aantal redenen (besproken in 1) is. Eerste infectie met het pathogeen is zeer reproduceerbaar en induceert een sterke Th1 en cellulaire immuunrespons. Anderzijds in subletale infecties, bacteriële verontreiniging wordt geconcentreerd in de lever en milt die gemakkelijk kan worden gemeten. Ten derde kan de ziekteverwekker veilig worden behandeld onder Biosafety Level 2 (BSL2) omstandigheden. Ten vierde, het organisme en de immuunrespons die wordt gegenereerd zijn uitgebreid gekarakteriseerd. Tenslotte zijn verschillende mutant en genetisch gemodificeerde stammen ontwikkeld die beschikbaar zijn voor gebruik.
Hier beschreven is een eenvoudig protocol voor inoculatie van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van L. monocytogenes en 25 voor het meten van IFN – γ reresponsies door NK, NKT en adaptieve lymfocyten na infectie. Ook beschreven is hoe bacteriële verontreiniging in de milt en lever meten nadat subletale infectie en overleving studies na infectie uit te voeren met een gewijzigde LD 50 dosis van de ziekteverwekker. Tenslotte zijn representatieve gegevens weergegeven hoe dit protocol kan worden gebruikt om het effect van nieuwe behandelingen IFN-γ reacties en muis overleving screenen van L. monocytogenes infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol van hoe een eenvoudige experimentele besmetting uit te voeren met de EGD stam van L. monocytogenes 25 in mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6J muizen. Dit protocol werd opgezet met het oog op het bestuderen van het effect van een unieke chemische IS001 IFN-γ productie door aangeboren en adaptieve lymfocyten in vivo 31. Door het monitoren bacteriële verwijdering en overleving na infectie werden inzichten in hoe deze veranderingen in IFN-γ beïnvlo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
