Infection expérimentale avec<em> Listeria monocytogenes</em> En tant que modèle pour l'étude de l'hôte Réponses Interféron-y
Summary
Ce protocole décrit comment inoculer des souris C57BL / 6J avec la souche EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) et de mesurer l' interféron-γ (IFN-γ) Réponses par tueuses naturelles (NK), T (NKT) des cellules tueuses naturelles, et adaptative des lymphocytes T post-infection. Ce protocole décrit également la façon de mener des études de survie chez les souris après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène.
Abstract
L. monocytogenes est une bactérie Gram-positif qui est une cause de maladies d' origine alimentaire chez les humains. L'infection expérimentale de souris avec cet agent pathogène a été très informatif sur le rôle des cellules du système immunitaire innée et adaptative et des cytokines spécifiques de l'immunité de l'hôte contre les pathogènes intracellulaires. La production d'IFN-γ par des cellules innées lors de l' infection par L. monocytogenes sublétale est importante pour l' activation des macrophages et le contrôle précoce de l'agent pathogène 1-3. En outre, la production d' IFN-γ par les lymphocytes mémoire adaptative est importante pour amorcer l'activation des cellules innée à 4 réinfection. Le L. monocytogenes modèle d'infection sert ainsi un excellent outil pour examiner si de nouvelles thérapies qui sont conçus pour augmenter la production d' IFN-γ ont un impact sur les réponses de l' IFN-γ in vivo et ont des effets biologiques productifs tels que l' augmentation de la clairance bactérienne ou l' amélioration de la survie de la souris deinfection. Décrite ici est un protocole de base pour la façon de mener les infections intra – péritonéales de souris C57BL / 6J avec la souche EGD de L. monocytogenes et de mesurer la production d' IFN-γ par les cellules NK, les cellules NKT et les lymphocytes adaptatifs par cytométrie en flux. En outre, les procédures sont décrites: (1) croître et de préparer les bactéries pour l'inoculation (2), mesurer la charge bactérienne dans la rate et le foie, et (3) mesure la survie des animaux de points d'extrémité. Des données représentatives sont également fournis pour illustrer la façon dont ce modèle d'infection peut être utilisée pour tester l'effet d'agents spécifiques sur les réponses d' IFN-y pour L. monocytogenes et la survie des souris de cette infection.
Introduction
IFN-γ est une cytokine qui est essentielle pour la médiation de l' immunité contre les agents pathogènes intracellulaires et pour contrôler la croissance des tumeurs 5. L'importance de cette cytokine dans la résistance bactérienne est évidente dans l'observation que les humains avec des mutations dans la voie de signalisation de l' IFN-γ sont très sensibles à l' infection par des mycobactéries et salmonella 6. De même, des souris déficientes en soit l' IFN-γ ou les défauts d'exposition du récepteur de l' IFN-γ dans la résistance aux mycobactéries 7-9 et d' autres agents pathogènes intracellulaires , y compris L. monocytogenes 10,11, 12 Leishmania major, Salmonella typhimurium 13 et 11 certains virus. En plus des agents pathogènes la lutte contre, l' IFN-γ joue un rôle crucial dans l' hôte de défense contre les tumeurs 14. Bien que la production accrue d'IFN-γ est bénéfique dans le contexte d'une infection ou d'un cancer, la production prolongée de cette cytokine a été liée tle diabète o le développement de l' auto – immunité systémique 15-17 et l'accélération de type I dans le modèle de souris diabétique non obèse 18.
Les principales sources d'IFN-γ comprennent les cellules NK, les cellules NKT, les lymphocytes T yô, helper 1 (Th1) des cellules T et des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 5,19,20. IFN-γ améliore l'immunité innée et adaptative par: (1) vers le haut de régulation complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et à l'expression II, (2) l'augmentation de l'expression des molécules co-stimulatrices sur les cellules présentatrices d'antigène, (3) macrophage améliorant phagocytose et la production de cytokines pro-inflammatoires et microbicides facteurs (par exemple, l' oxyde nitrique et les espèces réactives de l' oxygène), (4) la promotion de la différenciation des cellules T CD4 + naïves en cellules effectrices Th1, (5) la promotion de la commutation de classe d'anticorps à l' immunoglobuline ( Ig) 2a et IgG3 (chez la souris), (6) l'induction de la production de chimiokines pour recruter des cellules immunitaires aux sites d'infection, et (7) le renforcement de cellules NK et réponses CTL 5,19. Compte tenu de l'importance capitale de l' IFN-γ dans la réponse de l' hôte aux agents pathogènes et les tumeurs, l' IFN-γ recombinant a été testé en tant que traitement de diverses infections et de tumeurs malignes (passé en revue dans 19). Cependant, parce que l' administration systémique de l' IFN-γ ou la cytokine promotion Th1 interleukine-12 (IL-12) est associé à des effets secondaires et liée à la dose de toxicité 19,21, il y a intérêt à développer des stratégies alternatives pour augmenter la production d'IFN-γ par les cellules immunitaires. Développement de nouveaux produits biologiques et de petites molécules nécessite des outils de dépistage in vivo pour tester si ces agents augmentent la production d' IFN-γ au cours d' une réponse immunitaire et si cela se traduit par des effets biologiques significatifs tels que l' augmentation de la survie des animaux.
L' infection expérimentale de souris avec la bactérie L. monocytogenes gram-positives a été un modèle instrumental pourdéchiffrer le rôle de l' IFN-γ dans l' hôte une immunité contre les agents pathogènes intracellulaires 1,22. L'infection des souris avec l'agent pathogène par voie intraveineuse ou intrapéritonéale (ip) conduit à la diffusion rapide des bactéries à la rate et le foie, où ils deviennent internalisés par les macrophages résidents et les hépatocytes avec des charges bactériennes de pointe dans la rate qui se produisent entre 3 et 4 jours post infection 1,3,22. La production d'IFN-γ par les cellules NK est importante pour l' activation des macrophages et une résistance précoce contre le pathogène 3; mais à des doses infectieuses élevées, la production d'IFN-γ peut également être préjudiciable à la clairance de l' agent pathogène 23. Les cellules NKT sont également une source d'IFN-γ dans la rate et le foie pendant le contrôle précoce des agents pathogènes 2,24 et cette production a été montré pour amplifier la production d' IFN-γ par d' autres types cellulaires , notamment les cellules NK 2. D'autre part, plus tard, agissant lymphocytes T adaptatifs, des cellules T CD8 + en particulier, sont importants pour la médiation de la clairance de l'agent pathogène et de fournir une protection contre la réinfection 1,4,22.
Ce modèle d'infection a été attrayante pour les chercheurs pour un certain nombre de raisons (examiné en 1). Tout d'abord, l'infection par l'agent pathogène est hautement reproductible et induit une forte réponse immunitaire Th1 et cellulaire. Deuxièmement, lors de l'infection sublétale, la charge bactérienne est concentrée dans le foie et la rate où il peut être facilement mesurée. Troisièmement, l'agent pathogène peut être manipulé en toute sécurité sous le niveau de biosécurité 2 (NSB2) conditions. En quatrième lieu, l'organisme et la réponse immunitaire qu'il engendre ont été largement caractérisées. Enfin, une variété de souches mutantes ou génétiquement modifiés ont été développés qui sont disponibles pour l'utilisation.
Décrit ici est un protocole de base pour l' inoculation de souris C57BL / 6J avec la souche EGD de L. monocytogenes 25 et pour mesurer l' IFN – γ reponses par NK, NKT et les lymphocytes adaptatifs post-infection. On décrit également la façon de mesurer la charge bactérienne dans la rate et le foie après l' infection sublétale et de réaliser des études de survie après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène. Enfin, les données représentatives sont présentées de la manière dont ce protocole peut être utilisé pour cribler les effets de nouveaux traitements sur les réponses IFN-y et la survie de la souris de l' infection par L. monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole sur la façon de procéder à une infection expérimentale de base avec la souche EGD de L. monocytogenes 25 C57BL / 6J mâles ou femelles. Ce protocole a été mis en place dans le but d'étudier l'effet d'une nouvelle petite molécule IS001 sur la production d' IFN-γ par les lymphocytes innées et adaptatives in vivo 31. En surveillant la clairance bactérienne et la survie post-infection, des idées ont été acquises sur la fa?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
