と実験感染<em>リステリア菌</em>ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、
Summary
このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。
Abstract
リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介性疾患の原因であるグラム陽性細菌です。この病原体によるマウスの実験的感染は、細胞内病原体に対する宿主の免疫における自然免疫と適応免疫細胞および特定のサイトカインの役割に非常に有益となっています。 リステリア菌と亜致死感染の間の生来の細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージおよび病原体1-3の初期の制御を活性化するために重要です。また、適応メモリリンパ球によるIFN-γ産生が再感染4時に先天性細胞の活性化をプライミングするために重要です。 L.は、このように感染モデルをモノサイトゲネス IFN-γの産生を増加させるために設計されている新しい治療法は、in vivoでの IFN-γ応答に影響を与えると、そのような細菌のクリアランスを大きくするか、マウスの生存率を向上させるなどの生産的な生物学的効果を持っているかどうかを調査するための優れたツールとして機能しますから感染。 リステリア菌のEGD株とC57BL / 6Jマウスの腹腔内感染を行うために、フローサイトメトリーによって、NK細胞、NKT細胞、および適応リンパ球によるIFN-γの産生を測定する方法のための基本的なプロトコルは、ここで説明します。 （1）成長し、接種菌を調製し、（2）脾臓及び肝臓における細菌負荷を測定し、エンドポイント（3）測定動物の生存：また、手順がに記載されています。代表的なデータは、この感染モデルは、 リステリア・モノサイトゲネスおよびこの感染からマウスの生存に対するIFN-γ応答の特定の薬剤の効果を試験するために使用することができる方法を説明するために提供されます。
Introduction
IFN-γは、細胞内病原体に対する免疫を媒介するため、腫瘍の成長5を制御するために重要であるサイトカインです。耐性菌におけるこのサイトカインの重要性は、IFN-γシグナル伝達経路に変異を有する人間観察に明らかであるマイコバクテリアやサルモネラ菌6での感染を非常に受けやすいです。同様に、マイコバクテリア7-9とL.を含む他の細胞内病原体に対するIFN-γまたは抵抗のIFN-γ受容体展示欠陥のいずれかを欠損したマウスは、10,11、 リーシュマニア 12、 ネズミチフス菌 13、および特定のウイルス11 モノ サイトゲネス 。病原体に対抗することに加えて、IFN-γは、腫瘍14に対する宿主防御に重要な役割を果たしています。 IFN-γの高い生産は、感染または癌の文脈において有益であるが、このサイトカインの持続的生産はトンをリンクされています全身性自己免疫15-17と非肥満糖尿病マウスモデル18におけるI型糖尿病の加速の開発O。
IFN-γの主要な源は、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、Tヘルパー1（Th1）細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）5,19,20を含みます。 IFN-γは、によって先天性および適応免疫の両方を増強する：（1）アップレギュレート（3）強化マクロファージ、（2）抗原提示細胞上の共刺激分子の発現を増加させる、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびII発現を食作用および炎症性サイトカインの産生および殺菌因子（ 例えば 、一酸化窒素および活性酸素種）、（4）（5）（免疫グロブリン抗体のクラススイッチを促進するTh1エフェクター細胞へのナイーブCD4 + T細胞の分化を促進します（）マウスにおけるIg）図2aおよびIgG3、（6）は、iの部位に免疫細胞を動員するケモカインの産生を誘導しますnfection、及び（7）NK細胞およびCTL応答5,19を高めます。病原体および腫瘍に対する宿主応答におけるIFN-γの決定的な重要性を考えると、組換えIFN-γは（19件）様々な感染症や悪性腫瘍の治療薬として試験されています。 IFN-γまたはのTh1促進サイトカインインターロイキン-12（IL-12）の全身投与は、副作用および用量関連毒性19,21に関連付けられているためしかし、によりIFN-γ産生を増加するための代替戦略を開発することに関心があります免疫細胞。新しい生物製剤と小分子の開発は、このような薬剤は、免疫応答の間に、これは、このような動物の生存の増加などの意味のある生物学的作用に変換するかどうかのIFN-γ産生を増加させるかどうかをテストするためにin vivoでスクリーニングツールが必要です。
グラム陽性細菌リステリア菌によるマウスの実験的感染は、のために尽力したモデルとなっています細胞内病原体1,22に対する宿主免疫におけるIFN-γの役割を解読します。静脈内または腹腔内病原体（IP）によるマウスの感染は、それらが脾臓中のピークの細菌負荷が3と4日の間に発生すると常駐マクロファージおよび肝細胞によって内在なり脾臓および肝臓に細菌の急速な普及につながる後感染1,3,22。 NK細胞によるIFN-γの産生は、マクロファージの活性化及び病原体3に対する早期の抵抗のために重要です。しかし高感染性用量で、IFN-γの産生も病原体のクリアランス23に損害を与える恐れがあります。 NKT細胞は、病原体2,24の初期制御時の脾臓および肝臓におけるIFN-γの供給源であり、この生産は、NK細胞2を含む他の細胞型によってIFN-γ産生を増幅することが示されています。一方、後に作用する適応型Tリンパ球パルティで、CD8 + T細胞cularは、病原体のクリアランスを媒介し、再感染1,4,22に対する保護を提供するために重要です。
この感染モデルは、（1件）いくつかの理由のための研究者にとって魅力となっています。まず、病原体による感染は非常に再現性があり、強力なTh1および細胞性免疫応答を誘導します。第二に、致死感染中に、細菌負荷は、それが容易に測定することができ、肝臓及び脾臓に集中しています。第三に、病原体を安全バイオセーフティーレベル2（BSL2）条件下で取り扱うことができます。第四に、生物とそれが広範囲に特徴づけられている生成する免疫応答。最後に、変異体および遺伝的に改変された株の様々な使用のために利用可能であるが開発されています。
ここで説明するL.のEGD株とC57BL / 6Jマウスの接種のための基本的なプロトコルは25とIFNを測定するためのモノサイトゲネスれる–再γNK、NKT、および適応リンパ球感染後によりsponses。また、致死感染後の脾臓および肝臓における細菌負荷を測定し、病原体の改変LD 50用量での感染後の生存研究を行う方法について説明します。最後に、代表的なデータは、このプロトコルはL.、感染モノサイトゲネスからのIFN-γ応答およびマウス生存に対する新規治療法の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、LのEGD株はオスまたはメスC57BL / 6Jマウスに25を モノサイトゲネスでの基本的な感染実験を実施する方法のプロトコルを記述します。このプロトコルは、インビボ 31 に先天性および適応リンパ球によるIFN-γ産生に対する新しい小分子IS001の効果を研究するために設立されました。細菌クリアランスと生存感染後を監視することにより、洞察?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
