Experimentelle Infektion mit<em> Listeria monocytogenes</em> Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

Summary

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J – Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer – T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD ₅₀ Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Abstract

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers ^1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ – Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion ^4. Die L. monocytogenes – Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ – Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J – Mäusen zu führen und IFN-γ – Produktion durch NK – Zellen, NKT – Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Introduction

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums ⁵ entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ – Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen ⁶ Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ – Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien ^7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes ^10,11, Leishmania major ^12, S. typhimurium ¹³ und bestimmte Viren ^11. Neben der Bekämpfung von Krankheitserregern, IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen Tumoren ^14. Obwohl höhere Produktion von IFN-γ im Rahmen einer Infektion oder Krebs nützlich ist, verlängerte Produktion dieses Zytokins wurde t verknüpfto der Entwicklung von systemischer Autoimmunität ^15-17 und der Beschleunigung von Diabetes Typ I in dem nicht-fettleibigen diabetischen Maus – Modell ^18.

Die Hauptquellen von IFN-γ sind : NK – Zellen, NKT – Zellen, γδ – T – Zellen, T – Helfer 1 (Th1) -Zellen, und zytotoxischen T – Lymphozyten (CTL) ^5,19,20. IFN-γ erhöht sowohl angeborenen und erworbenen Immunität durch: (1) Hochregulieren Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und II-Expression, (2) die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen zu erhöhen, (3) Verbesserung der Makrophagen Phagozytose und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und mikrobizide Faktoren (beispielsweise Stickstoffmonoxid und reaktive Sauerstoffspezies), (4) die Förderung der Differenzierung von naiven CD4 ⁺ T – Zellen in Th1 – Effektorzellen, (5) Förderung der Antikörperklasse Umschaltung auf Immunglobulin ( Ig) 2a und IgG3 (in der Maus), (6) Induzierung der Produktion von Chemokinen Immunzellen-Stellen von i zu rekrutierennfection und (7) Verbesserung der NK – Zellen und CTL – Antworten ^5,19. Aufgrund der entscheidenden Bedeutung der IFN-γ in der Wirtsantwort auf Pathogene und Tumore, rekombinantes IFN-γ wurde als Behandlung für verschiedene Infektionen und Malignitäten (in ¹⁹ überprüft) getestet. Da jedoch die systemische Verabreichung von IFN-γ oder Th1 Zytokin Förderung Interleukin-12 (IL-12) mit Nebenwirkungen verbunden ist und dosisabhängige Toxizität ^19,21 besteht ein Interesse alternative Strategien bei der Entwicklung von IFN-γ – Produktion zu erhöhen , indem Immunzellen. Entwicklung neuer Biologika und kleinen Molekülen erfordert in vivo Screening – Tools zu testen , ob solche Mittel während einer Immunantwort IFN-γ Produktion zu erhöhen , und ob dies in einer sinnvollen biologischen Wirkungen wie Erhöhung der das Überleben der Tiere.

Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem grampositiven Bakterium L. monocytogenes ist ein Instrumental – Modell seitEntschlüsselung der Rolle von IFN-γ in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger ^1,22. Infektion von Mäusen mit dem Pathogen intravenös oder intraperitoneal (ip) führt zur schnellen Verbreitung der Bakterien an der Milz und der Leber, wo sie von Makrophagen und Hepatozyten mit peak bakterielle Belastungen in der Milz internalisiert zwischen 3 und 4 Tage auftretenden post- Infektion ^1,3,22. Produktion von IFN-γ durch NK – Zellen ist wichtig für die Makrophagenaktivierung und frühen Widerstand gegen den Erreger ^3; jedoch bei hohen Infektionsdosen, die Produktion von IFN-γ kann auch auf Erreger – Clearance ²³ schädlich sein. NKT – Zellen sind auch eine Quelle von IFN-γ in der Milz und Leber während der frühen Kontrolle von Pathogenen ^2,24 und diese Produktion wurde ² gezeigt , IFN-γ – Produktion durch andere Zelltypen , einschließlich NK – Zellen verstärken. Auf der anderen Seite, die später wirkenden adaptive T – Lymphozyten, CD8 ⁺ T – Zellen in partidere sind wichtig für das Spiel des Erregers zu vermitteln und den Schutz gegen eine erneute Infektion ^1,4,22 bereitstellt.

Diese Infektionsmodell wurde für eine Reihe von Gründen für Forscher attraktiv war ( beschrieben in ^1). Erstens, eine Infektion mit dem Pathogen ist in hohem Maße reproduzierbar und induziert eine starke Th1 und zellulären Immunantwort. Zweitens, während subletalen Infektion wird bakterielle Belastung in der Leber und der Milz konzentriert, wo es kann leicht gemessen werden. Drittens kann der Erreger sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen behandelt werden. Viertens der Organismus und die Immunantwort, dass es weitgehend charakterisiert worden erzeugt. Schließlich wurde eine Vielzahl von Mutanten und genetisch veränderte Stämme entwickelt, die für die Verwendung zur Verfügung stehen.

Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für die Impfung von C57BL / 6J – Mäuse mit dem EGD Stamm von L. monocytogenes und ²⁵ für IFN Messung – γ reAntworten von NK, NKT und adaptive Lymphozyten nach der Infektion. Beschrieben ist , wie bakterielle Belastung in der Milz und Leber nach subletalen Infektion zu messen , und die Überlebensstudien nach der Infektion durchgeführt werden mit einer modifizierten LD ₅₀ -Dosis des Pathogens. Schließlich werden repräsentative Daten gezeigt, wie kann dieses Protokoll verwendet werden , um die Wirkung neuer Therapien auf IFN-γ – Antworten und das Überleben der Mäuse zum Screening von L. monocytogenes Infektion.

Protocol

Sicherheitserklärung Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit lebenden L. monocytogenes. Der Erreger wird durch geschultes Personal sicher unter BSL2 Bedingungen behandelt, die nicht immunsupprimierten. Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind schwangere Frauen, ältere Menschen und Personen, die HIV-infiziert sind oder chronischen Erkrankungen, die Behandlung mit einer immunsuppressiven Therapie erfordern. Das Personal sollte eine Schutzlaborkittel oder Kittel, Hands…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT – Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 5 CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating – Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR & agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkont…

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes ²⁵ bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J – Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo ³¹ eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenn…

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified	BD	299070	any brand should be appropriate
Agar	BD	214010	any brand should be appropriate
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	any brand should be appropriate
1xPBS	Sigma	D8537	any brand should be appropriate
TissueLyser II	Qiagen	85300	any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl)			any brand should be appropriate
KHCO3			any brand should be appropriate
Na2EDTA			any brand should be appropriate
RPMI 1640	Gibco	22400089	any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum	Gibco	12483	Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine	Gibco	25030	any brand should be appropriate
Non-essential amino acids	Gibco	11140	any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)	BD	554724	Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer	BD	554723	Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience	65-0866	Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)	eBioscience	15-0041	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)	eBioscience	11-0081	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC	NIH Tetramer Core Facility	N/A	Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)	eBioscience	25-5961	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)	eBioscience	47-3351	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)	eBioscience	25-0451	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)	eBioscience	12-7311	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit	eBioscience	88-7314	Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture			Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes			any brand should be appropriate
bacterial petri dishes			any brand should be appropriate
2 ml cyrovials			any brand should be appropriate
UV spectrometer			any brand should be appropriate
safety engineered needles			any brand should be appropriate
C57BL6/J	Jackson laboratories	Stock#000664	Order for arrival at 7 wks
Bleach			For decontamination
70% Ethanol			For decontamination
Glass beads			any brand should be appropriate
Centrifuge			rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge			any brand should be appropriate
Sterile Glycerol			any brand should be appropriate
Pipette Tips			any brand should be appropriate
Pipette			any brand should be appropriate
Surgical instruments			any brand should be appropriate
70 micron strainers			any brand should be appropriate
3 ml syringe			any brand should be appropriate
Pipette gun			any brand should be appropriate
Filtration Units			any brand should be appropriate
Trypan Blue			Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer			any brand should be appropriate
Round bottomed plates			any brand should be appropriate
FACs tubes	BD
BD LSR II	BD		Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software	Treestar		Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl)	Eppendorf		Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid			Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System	Pro-lab Diagnositics		Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria