Infecção experimental com<em> Listeria monocytogenes</em> Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Summary

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD ₅₀ modificada do agente patogénico.

Abstract

L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva que é uma causa da doença de origem alimentar em humanos. A infecção experimental de ratinhos com este patogénio tem sido altamente informativos sobre o papel das células do sistema imune inata e adaptativa e citocinas específicas na imunidade do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares. Produção de IFN-γ por células inatas durante a infecção com L. monocytogenes subletal é importante para a activação de macrófagos e de controlo no início do patógeno ^1-3. Além disso, a produção de IFN-γ por linfócitos memória adaptativa é importante para aprontar a activação de células inatas sobre reinfecção ^4. A L. monocytogenes modelo de infecção, portanto, serve como uma grande ferramenta para investigar se novas terapias que são projetados para aumentar a produção de IFN-γ ter um impacto sobre respostas de IFN-γ in vivo e têm efeitos biológicos produtivos, tais como aumento da depuração bacteriana ou melhorar a sobrevivência do mouse a partir deinfecção. Aqui descrito é um protocolo de base para a forma de realizar infecções intraperitoneais de murganhos C57BL / 6J com a estirpe de L. monocytogenes EGD e para medir a produção de IFN-γ pelas células NK, células NKT, e adaptativas linfócitos por citometria de fluxo. Além disso, os procedimentos são descritos em: (1) crescimento e preparar as bactérias para inoculação, (2) medir a carga bacteriana no baço e no fígado, e (3) medida a sobrevivência dos animais a pontos finais. Os dados representativos são também fornecidos para ilustrar a forma como este modelo de infecção pode ser utilizado para testar o efeito de agentes específicos nas respostas de IFN-gama para L. monocytogenes e sobrevivência dos ratinhos com esta infecção.

Introduction

IFN-γ é uma citocina que é crucial para mediar a imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares e para controlar o crescimento do tumor ^5. A importância desta citocina na resistência bacteriana é evidente na observação de que os seres humanos com mutações na via de sinalização de IFN-γ são altamente susceptíveis à infecção com micobactérias e salmonelas ^6. De modo semelhante, os ratinhos deficientes em IFN-γ ou os defeitos exibem receptor de IFN-γ na resistência à micobactérias ^7-9 e outros patogénios intracelulares, incluindo L. monocytogenes ^10,11, Leishmania major ^{12, 13} Salmonella typhimurium, e certos vírus ^11. Em adição aos agentes patogénicos que combatem, IFN-γ desempenha um papel fundamental na defesa contra ^{hospedeiro-14} tumores. Embora uma maior produção de IFN-γ é benéfica no contexto da infecção ou cancro, a produção prolongada desta citocina tem sido associada to o desenvolvimento de auto-imunidade sistémica ^15-17 e a aceleração da diabetes do tipo I no modelo de ratinho diabético não obeso ^18.

As principais fontes de IFN-γ incluem células NK, células NKT, γδ células T, células T auxiliares 1 (Th1), e linfócitos T citotóxicos (CTL) ^5,19,20. IFN-γ aumenta tanto a imunidade inata e adaptativa por: (1) para cima de regulação de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e expressão II, (2) aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias em células que apresentam antigénios, (3) de macrófagos aumentando factores de fagocitose e a produção de citocinas pró-inflamatórias e microbicidas (por exemplo, óxido nítrico e espécies reactivas de oxigénio), (4) promover a diferenciação de células T CD4 ⁺ naive em células efectoras Th1, (5) promover a troca de classe de anticorpo para a imunoglobulina ( Ig) 2a e IgG3 (no rato), (6) indução da produção de quimiocinas para recrutar células imunes para os locais de Infection, e (7) o aumento de células NK e respostas CTL ^5,19. Dada a importância crucial de IFN-γ na resposta do hospedeiro a infecções e tumores, recombinante IFN-γ foi testado como um tratamento para várias infecções e doenças malignas (revisto em ^19). No entanto, porque a administração sistémica de IFN-γ ou promover a citoquina Th1 interleucina-12 (IL-12) está associada a efeitos colaterais e toxicidade relacionada com a dose ^19,21, há interesse no desenvolvimento de estratégias alternativas para aumentar a produção de IFN-γ pela células do sistema imunológico. O desenvolvimento de novos produtos biológicos e moléculas pequenas requer em ferramentas de rastreio in vivo para testar se tais agentes de aumento da produção de IFN-γ durante uma resposta imune e se isto traduz-se efeitos biológicos significativos, tais como aumentos de sobrevivência do animal.

A infecção experimental de ratinhos com a bactéria L. monocytogenes gram-positiva tem sido um modelo para instrumentaldecifrar o papel do IFN-γ no hospedeiro-imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares ^1,22. Infecção de camundongos com o patógeno por via intravenosa ou por via intraperitoneal (ip) leva à rápida disseminação da bactéria para o baço e fígado, onde eles se tornam internalizadas pelos macrófagos residentes e hepatócitos com cargas bacterianas pico no baço ocorrem entre 3 e 4 dias pós- infecção ^1,3,22. Produção de IFN-γ por células NK é importante para a activação de macrófagos e resistência precoce contra o agente patogénico ^3; No entanto, em doses infecciosas elevados, a produção de IFN-γ também pode ser prejudicial para a depuração de agentes patogénicos ^23. As células NKT são também uma fonte de IFN-γ no baço e no fígado durante o controlo de início de patógenos ^2,24 e essa produção foi mostrado para amplificar a produção de IFN-γ por outros tipos de células, incluindo células NK ^2. Por outro lado, mais tarde, que actuam linfócitos T adaptativos, células T CD8 ⁺ em particular, são importantes para mediar a folga do patógeno ea protecção contra ^1,4,22 re-infecção.

Este modelo de infecção tem sido atraente para os investigadores para uma série de razões (revisto em ^1). Em primeiro lugar, a infecção com o agente patogénico é altamente reprodutível e induz uma forte resposta imunitária Th1 e celular. Em segundo lugar, durante a infecção subletal, carga bacteriana está concentrado no fígado e baço, onde ele pode ser facilmente medido. Em terceiro lugar, o agente patogénico pode ser manuseado com segurança sob condições de segurança biológica de nível 2 (BSL2). Em quarto lugar, o organismo e a resposta imune que gera têm sido extensivamente caracterizados. Finalmente, uma variedade de estirpes mutantes e geneticamente modificadas têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para uso.

Descrito aqui é um protocolo básico para inoculação de camundongos C57BL / 6J com a estirpe EGD de L. monocytogenes ²⁵ e para medir IFN – γ rerespos- por NK, NKT, e os linfócitos adaptativos pós-infecção. Também é descrito como para medir a carga bacteriana no baço e no fígado após a infecção subletal e para realizar estudos de sobrevivência após a infecção com uma dose de LD ₅₀ modificada do agente patogénico. Finalmente, os dados representativos são mostrados de como este protocolo pode ser utilizado para pesquisar o efeito de novos tratamentos sobre as respostas de IFN-y e sobrevivência do ratinho de infecção por L. monocytogenes.

Protocol

Declaração de segurança Este protocolo descreve a infecção de ratinhos com L. monocytogenes vivo. O patógeno é tratado com segurança sob condições BSL2 por pessoal treinado que não estão imunocomprometidos. pessoas imunodeprimidas incluem mulheres grávidas, idosos e indivíduos que estão infectadas pelo HIV ou que tenham condições crônicas que necessitam de tratamento com terapia imunossupressora. O pessoal deve vestir um revestimento protetor laboratório ou vestido,…

Representative Results

A Figura 3 apresenta algum fluxo típico citometria de coloração de IFN-γ em células NK e NKT esplénicas às 24 h pós-infecção com 10 5 CFU de o agente patogénico. Esta figura também ilustra a estratégia de propagação para o painel de coloração descrito na Tabela 2. A Figura 4 mostra alguns dados representativos que foram obtidos numa experiência em que ratos machos foram tratados com o antagonista de PPAR? IS0…

Discussion

Descrevemos aqui um protocolo de como levar a cabo uma infecção experimental de base com a estirpe de L. monocytogenes EGD de ²⁵ em camundongos C57BL / 6J machos ou fêmeas. Este protocolo foi criado com a finalidade de estudar o efeito de uma molécula pequena novela IS001 sobre a produção de IFN-γ por linfócitos inata e adaptativa in vivo ^31. Ao monitorar depuração bacteriana e sobrevivência pós-infecção, percepções foram obtidas em como essas mudanças em IFN-γ c…

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified	BD	299070	any brand should be appropriate
Agar	BD	214010	any brand should be appropriate
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	any brand should be appropriate
1xPBS	Sigma	D8537	any brand should be appropriate
TissueLyser II	Qiagen	85300	any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl)			any brand should be appropriate
KHCO3			any brand should be appropriate
Na2EDTA			any brand should be appropriate
RPMI 1640	Gibco	22400089	any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum	Gibco	12483	Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine	Gibco	25030	any brand should be appropriate
Non-essential amino acids	Gibco	11140	any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)	BD	554724	Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer	BD	554723	Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience	65-0866	Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)	eBioscience	15-0041	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)	eBioscience	11-0081	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC	NIH Tetramer Core Facility	N/A	Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)	eBioscience	25-5961	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)	eBioscience	47-3351	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)	eBioscience	25-0451	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)	eBioscience	12-7311	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit	eBioscience	88-7314	Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture			Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes			any brand should be appropriate
bacterial petri dishes			any brand should be appropriate
2 ml cyrovials			any brand should be appropriate
UV spectrometer			any brand should be appropriate
safety engineered needles			any brand should be appropriate
C57BL6/J	Jackson laboratories	Stock#000664	Order for arrival at 7 wks
Bleach			For decontamination
70% Ethanol			For decontamination
Glass beads			any brand should be appropriate
Centrifuge			rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge			any brand should be appropriate
Sterile Glycerol			any brand should be appropriate
Pipette Tips			any brand should be appropriate
Pipette			any brand should be appropriate
Surgical instruments			any brand should be appropriate
70 micron strainers			any brand should be appropriate
3 ml syringe			any brand should be appropriate
Pipette gun			any brand should be appropriate
Filtration Units			any brand should be appropriate
Trypan Blue			Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer			any brand should be appropriate
Round bottomed plates			any brand should be appropriate
FACs tubes	BD
BD LSR II	BD		Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software	Treestar		Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl)	Eppendorf		Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid			Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System	Pro-lab Diagnositics		Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria