Infezione sperimentale con<em> Listeria monocytogenes</em> Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

Summary

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL ₅₀ dosi del patogeno.

Abstract

L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell'ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l'infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l'attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno ^1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l'innesco l'attivazione delle cellule innate upon reinfezione ^4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l'aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l'inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l'effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.

Introduction

IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l'immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale ^5. L'importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell'osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all'infezione con micobatteri e salmonelle ^6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri ^7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes ^10,11, Leishmania importante ^12, Salmonella typhimurium ^13, e alcuni virus ^11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori ^14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica ^15-17 e l'accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo ^18.

Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) ^5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l'antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l'ossido di azoto e le specie reattive dell'ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 ⁺ naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL ^5,19. Data l'importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell'ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in ^19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l'interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità ^19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede de strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l'aumento della sopravvivenza degli animali.

Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari ^1,22. L'infezione dei topi con l'agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione ^1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l'attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l'agente patogeno ^3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni ^23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni ^2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK ^2. D'altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 ⁺ in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione ^1,4,22.

Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in ^1). Innanzitutto, l'infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l'infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l'agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l'organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l'uso.

Qui descritto è un protocollo di base per l'inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes ²⁵ e per la misura di IFN – γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l'infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD ₅₀ dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l'effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.

Protocol

Dichiarazione di sicurezza Questo protocollo descrive infezione di topi con vivo L. monocytogenes. L'agente patogeno è gestito in modo sicuro in condizioni BSL2 da personale addestrato che non sono immunocompromessi. persone immunocompromessi includono le donne incinte, gli anziani e le persone che sono HIV-infetti o che hanno patologie croniche che richiedono un trattamento con la terapia immunosoppressiva. Il personale deve indossare un camice protettivo laboratorio o camice, g…

Representative Results

La figura 3 presenta alcune tipico flusso citometria colorazione di IFN-γ in cellule NK e NKT milza a dopo l'infezione 24 ore con 10 CFU 5 del patogeno. Questa figura illustra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritto nella Tabella 2. La figura 4 mostra alcuni dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati con la IS001 o il veicolo di contro…

Discussion

Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes ²⁵ in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l'effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo ^31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l'infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti…

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified	BD	299070	any brand should be appropriate
Agar	BD	214010	any brand should be appropriate
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	any brand should be appropriate
1xPBS	Sigma	D8537	any brand should be appropriate
TissueLyser II	Qiagen	85300	any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl)			any brand should be appropriate
KHCO3			any brand should be appropriate
Na2EDTA			any brand should be appropriate
RPMI 1640	Gibco	22400089	any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum	Gibco	12483	Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine	Gibco	25030	any brand should be appropriate
Non-essential amino acids	Gibco	11140	any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)	BD	554724	Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer	BD	554723	Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience	65-0866	Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)	eBioscience	15-0041	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)	eBioscience	11-0081	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC	NIH Tetramer Core Facility	N/A	Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)	eBioscience	25-5961	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)	eBioscience	47-3351	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)	eBioscience	25-0451	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)	eBioscience	12-7311	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111	Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit	eBioscience	88-7314	Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture			Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes			any brand should be appropriate
bacterial petri dishes			any brand should be appropriate
2 ml cyrovials			any brand should be appropriate
UV spectrometer			any brand should be appropriate
safety engineered needles			any brand should be appropriate
C57BL6/J	Jackson laboratories	Stock#000664	Order for arrival at 7 wks
Bleach			For decontamination
70% Ethanol			For decontamination
Glass beads			any brand should be appropriate
Centrifuge			rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge			any brand should be appropriate
Sterile Glycerol			any brand should be appropriate
Pipette Tips			any brand should be appropriate
Pipette			any brand should be appropriate
Surgical instruments			any brand should be appropriate
70 micron strainers			any brand should be appropriate
3 ml syringe			any brand should be appropriate
Pipette gun			any brand should be appropriate
Filtration Units			any brand should be appropriate
Trypan Blue			Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer			any brand should be appropriate
Round bottomed plates			any brand should be appropriate
FACs tubes	BD
BD LSR II	BD		Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software	Treestar		Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl)	Eppendorf		Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid			Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System	Pro-lab Diagnositics		Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria