신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종 널리 단백질 현지화 및 세포 골격 리모델링 및 살아있는 세포에서 소포 인신 매매 등의 이벤트의 역학을 공부하는 도구를 사용합니다. 키메라 GFP 융합을 사용하여 정량 방법은 많은 응용을 위해 개발되었다; 그러나, GFP는 단백질 분해에 어느 정도 내성 때문에 그 형광은 세포 내 이입 경로에화물 인신 매매의 정량을 방해 할 수있는 리소좀 / 공포에 계속. 이입 및 사후 이입 피킹 이벤트를 정량화하기위한 다른 방법은 superecliptic pHluorin 산성 환경에서 켄칭 GFP의 pH 민감성 변이체를 사용한다. multivesicular 기관 (MVBs)와 리소좀 / 공포 루멘에 전달하기로화물 통합에 따라 형광의 감쇠에 횡단화물 단백질 결과의 세포질 꼬리에 pHluorin의 키메라 융합. 따라서, 액포 형광의 담금질은 quantifi을 용이하게엔도 시토 시스와 세포 내 이입 경로에 이른 사건의 양이온. 이 논문은 형광 현미경을 통해 세포 내 이입의 정량 pHluorin 태그가화물을 사용하는 방법뿐만 아니라 유동 세포 계측법 사용 인구 기반의 분석에 대해 설명합니다.
Introduction
소포 피킹은 진핵 세포 내의 소기관 신원 및 기능을 유지하는 데 중요한 역할을하고, 각각의 세포 구획 막 단백질 및 조성물을 조절하기위한 중요한 메커니즘이다. 이입을 통해 생성 소체 후속 재활용 또는 리소좀 타겟팅에 대한 표면으로부터 막 단백질을 제거하는 반면 세포막에서 exocytic 소포 융합은 세포 표면 단백질 및 새로운 막을 제공한다. 따라서, 엔도 시토 시스는 영양 흡수 및 세포 외 환경에 대한 응답 중요하다. 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스는 세포막 표면적을 조절하기 위해, 손상된 단백질의 회전율을 균형있게된다.
효모 및 포유 동물 세포의 연구는 다양한 EN에 응답하여 세포 내 이입에 관련된 단백질의 대량뿐만 아니라 특정화물의 내재화를 촉진 여러 세포 내 이입 경로 또는 행위를 식별 한vironmental 조건. 가장 공부 경로는 클라과 세포질 액세서리 단백질이 초기 세포 내 이입 소포를 안정화 코트 구조로 조립하는 클라 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에의 실험 역학 및 많은 세포 내 이입 단백질 1-3 모집의 순서로 키 통찰력을 굴복했다. 특히, CME 기계가 매우 진화를 통해 보존되는 효모에서 CME 관련 단백질의 대부분은 인간 orthologs을 가지고; 따라서, 효모 신진 높은 진핵 생물에 보존되어 엔도 시토 시스의 메커니즘을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어, 출아 효모를 사용하는 연구가 추가로 세포 내 이입 액세서리 채용 하였다 CME 구조의 형성과 성숙 (효모 등 피질 액틴 패치 라 함) 클라화물 결합 어댑터 단백질부터 시작하여, 많은 단백질의 연속 채용 관련 결정 단백질,Arp2 / 3 매개 액틴의 중합의 활성화 및 소포 절단 1,2에 관여하는 단백질의 모집. 굴지 패치를 대뇌 피질하기 CME 기계 단백질의 모집은 높은 주문하고 진부한 과정, 많은 단백질 모집의 정확한 순서는 CME 기계의 다른 구성 요소에 대한 설립되었습니다. 중요한 것은, 최근의 연구는 포유 동물 세포 4 클라 코팅 된 구덩이에서 CME의 단백질을 모집 비슷한 순서를 확인했다.
CME 외에도 여러 종류의 세포는 세포막 5-7에서 소포 형성 및 내재화를 촉진하는 다른 메커니즘에 의존하는 하나 이상의 독립적 인 클라 세포 내 이입 (CIE) 경로를 갖는다. 효모, 우리는 최근에 작은는 GTPase Rho1 및 활성화 구아닌 염기 교환 계수 (GEF), ROM1 8,9을 활용하는 CIE 경로를 확인했다. Rho1은 액틴의 중합 (1)를 홍보하기 위해 formin Bni1를 활성화효모 12 클라 독립적 인 세포 내 이입이 양식에 필요한 0,11. 또한, 단백질의 α-아레스 가족은 유비퀴틴 리가 Rsp5은 CME 13-17을 통해화물 유비퀴틴 이후의 국제화를 촉진하고, 또한 CIE (18)에 관여하는 단백질과 가능성 직접적인 상호 작용을 통해 CIE 경로를 통해화물의 국제화를 촉진하기 위해 모집. CIE의 다양한 경로는 또한 Rho1의 ortholog, 9,19-에서 RhoA 의존 클라 독립적 식세포 경로를 포함한 포유 동물 세포에 존재한다. 포유 동물 CIE에서에서 RhoA의 역할은 제대로 이해된다; 따라서, 신진 효모의 연구는 포유류 CIE에 적용 할 수있는 추가 기계적인 통찰력을 제공 할 수있다.
세포 내 이입 사건의 정확한 정량화는 엔도 시토 시스를 조절하는 특정 단백질의 역할에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있으며,화물 내재화 또는 progressio에 돌연변이의 효과를 밝힐 수세포 내 이입 경로를 통해 N. 이를 위하여, 생화학 적 방법은 리간드 흡수를 모니터링하거나 세포 내 이입화물 단백질의 분해 속도를 측정하기 위해 이용 될 수있다. 살아있는 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP)과이자의화물에 그 변종의 융합은화물 운송의 직접 시각화 할 수 있습니다. GFP는 (효모 또는 공포) 리소좀에서 분해에 내성이 있기 때문에, GFP – 태그화물은 엔도 시토 시스의 정량 사용이 제한됩니다. 또한, GFP의 형광은 pH의 변화에 부분적으로 만 구분하며 20, 21 루멘 액포 내에서 검출 남아있다. 그 결과, GFP 태그 형광화물의 나머지가 저하되었으며,화물 강도 전체 셀 기반 정량 인해 액포 장기 GFP 형광에 부정확 할 수 오랜 후에 액포에 계속.
액포의 GFP 형광의 단점을 극복하기 위해, 우리는 이전 superecliptic pH를 사용했다luorin, 중성 pH에서 밝은 형광 있지만, 이러한 20,22,23 리소좀 액포 /의 루멘으로 산성 환경에서 형광을 상실 GFP의 pH에 민감한 변형. 세포 내 이입화물의 세포질 꼬리에 pHluorin 태그를 배치하면 세포막에와 pHluorin 태그가 세포질 (그림 1A)에 노출 된 상태로 유지 초기 엔도 좀,에화물의 시각화를 허용합니다. 초기 엔도 좀은 엔도 좀의 루멘에 꽃 봉오리 소포로 전송 (ESCRT) 기계 패키지 표면 지역화 된화물에 필요한 엔도 좀 정렬 복잡하고, 생성 multivesicular 기관 (MVBs) (24)를 성숙. 내부 MVB 소체에 포함 된화물의 경우, pHluorin 태그 소포 루멘을 향. 내부 MVB 소체는 산성화; 그들은 MVBs (20)에 성숙하여, pHluorin 태그가화물 초기 엔도 좀의 형광을 잃게됩니다. 액포와 MVB의 후속 융합은 MVB의 내강 내용을 제공합니다열화 및 pHluorin 태그는 액포 루멘의 산성 환경에서 급냉 유지.
이 논문은 효모의 세포질 pHluorin 태그로화물을 이용하여 정량적 인 세포 내 이입 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. pHluorin 태깅화물을 발현 균주 특정화물의 특성 및 피킹 동작에 따라, 운동 및 / 또는 엔드 포인트 분석에 사용될 수있다. 또한, 일부 pHluorin 태그가화물은 유동 세포 계측법을 포함하여 높은 처리량 분석 방법, 의무가 있습니다. 중요한 것은, pHluorin 태그는, 살아있는 세포에서 세포 내 이입 이벤트 공부 이입 및 야생형 및 돌연변이 균주에서 세포 내 이입 함수의 비교의 정량을 허용하는 다용도 공구이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효모 세포에서의 세포 내 이입 이벤트 정량 pHluorin의 적용은 태그 형광 단백질 (도 1a)의 세포질 테일에 융합 된 트랜스화물을 사용한다. pHluorin 태그가 중립적 인 환경에 노출되지는 않지만 pHluorin 태그가 산성 조건을 발견 한 경우 급냉 될 때 여기에 설명 된 분석의 경우,화물 밝은 형광이다. 따라서, 태그가 이입 pHluorin화물 용이 세포막의 세포질 표면에 초기 엔도 좀에서 검출되지만 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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