Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes son ampliamente utilizados para el estudio de las herramientas de localización de la proteína y la dinámica de los acontecimientos tales como la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular en las células vivas. utilizando metodologías cuantitativas GFP fusiones quiméricas se han desarrollado para muchas aplicaciones; Sin embargo, la GFP es algo resistente a la proteolisis, por tanto, su fluorescencia persiste en el lisosoma / vacuola, lo cual puede dificultar la cuantificación del tráfico de carga en la vía endocítica. Un método alternativo para la cuantificación de los eventos de tráfico de endocitosis y post-endocítica hace uso de superecliptic pHluorin, una variante sensible al pH de GFP que se apaga en ambientes ácidos. fusión quimérica de pHluorin a la cola citoplasmática de carga transmembrana proteínas resulta en una amortiguación de la fluorescencia tras la incorporación de la carga en los cuerpos multivesiculares (MVBs) y la entrega a la luz del lisosoma / vacuola. Por lo tanto, extinción de la fluorescencia vacuolar facilita cuantificación de endocitosis y primeros eventos en la vía endocítica. Este documento describe los métodos que utilizan cargas de etiquetado pHluorin para la cuantificación de la endocitosis por medio de microscopía de fluorescencia, así como ensayos basados en la población usando citometría de flujo.
Introduction
el tráfico vesicular juega un papel importante en el mantenimiento de la identidad y la función orgánulo en células eucariotas, y es un mecanismo clave para la regulación de proteínas y de la membrana composición de compartimientos celulares individuales. En la membrana de plasma, fusión de vesículas exocytic ofrece nuevas proteínas y las membranas de la superficie de la célula, mientras que las vesículas generadas a través de endocitosis eliminar membrana y proteínas de la superficie para el reciclaje o la orientación al lisosoma posterior. Por lo tanto, la endocitosis es importante para la absorción de nutrientes y para respuestas al entorno extracelular. Exocitosis y endocitosis están equilibrados para regular el área de superficie de la membrana plasmática, y para permitir renovación de las proteínas dañadas.
Los estudios en levaduras y células de mamíferos han identificado un gran número de proteínas implicadas en la endocitosis, así como múltiples vías endocítica que promueven la internalización de cargas específicas o que actúan en respuesta a una variedad de encondiciones ambientales. La vía mejor estudiada es la endocitosis mediada por clatrina (CME), en la que las proteínas de clatrina y accesorias citosólicas se ensamblan en una estructura de capa para estabilizar la vesícula endocítica naciente. Los experimentos en los ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae han arrojado información clave en la dinámica y la orden de contratación para muchas proteínas endocítica 1-3. En particular, la maquinaria CME está altamente conservada a través de la evolución de tal manera que la mayoría de las proteínas relacionadas con el CME en la levadura tiene ortólogos humanos; por lo tanto, la levadura en ciernes ha sido una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos de endocitosis que están conservados en eucariotas superiores. Por ejemplo, los estudios que utilizan levadura en ciernes determinaron que la formación y la maduración de las estructuras de CME (denominado a los parches de actina como corticales en la levadura) implica el reclutamiento secuencial de muchas proteínas, a partir de clatrina y adaptador de proteínas de unión con la carga, seguido por reclutamiento de accesorio endocítica adicional proteínas,la activación de la polimerización de actina mediada por 3 Arp2 /, y el reclutamiento de las proteínas implicadas en 1,2 vesícula escisión. El reclutamiento de proteínas de maquinaria CME a cortical parches de actina es un proceso altamente ordenado y estereotipada, y el orden preciso de la contratación para muchas proteínas se ha establecido con respecto a otros componentes de la maquinaria de CME. Es importante destacar que estudios recientes han confirmado una orden similar de reclutamiento para las proteínas de CME en depresiones revestidas de clatrina en células de mamífero 4.
Además de CME, muchos tipos de células poseen una o más vías de clatrina independiente endocítica (CIE) que se basan en mecanismos alternativos para promover la formación de vesículas y la internalización de la membrana plasmática 5-7. En la levadura, recientemente hemos identificado una vía de CIE que utiliza la pequeña GTPasa Rho1 y su factor de activación de guanina intercambio de nucleótidos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa el formin Bni1 para promover la polimerización de la actina 10,11, que se requiere para esta forma de endocitosis clathrin-independiente en la levadura 12. Por otra parte, la familia α-arrestina de proteínas reclutar la ubiquitina ligasa Rsp5 para promover la ubiquitinación de carga y la posterior interiorización a través de CME 13-17, y también promover la internalización de carga a través de la vía de CIE, posiblemente a través de la interacción directa con proteínas implicadas en la CIE 18. Una variedad de vías CIE también existen en células de mamífero, incluyendo las vías de clathrin independiente y fagocíticas que se basan en la ortholog Rho1, RhoA 9,19. El papel de RhoA en mamíferos CIE es poco conocida; por lo tanto, los estudios en levadura en ciernes pueden proporcionar conocimientos mecánicos adicionales que son aplicables a CIE mamíferos.
la cuantificación exacta de los acontecimientos de endocitosis puede proporcionar información importante acerca de las funciones de las proteínas específicas en la regulación de la endocitosis, y puede revelar los efectos de las mutaciones sobre la internalización de carga o progression a través de la vía endocítica. Para este propósito, los métodos bioquímicos se pueden utilizar para controlar la absorción de ligando o para medir las tasas de degradación de las proteínas de carga endocítica. En las células vivas, la fusión de proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes a cargas de interés permite la visualización directa de transporte de carga. Sin embargo, cargas GFP-etiquetados son de uso limitado para la cuantificación de la endocitosis porque GFP es resistente a la degradación en el lisosoma (o vacuola en levaduras). Por otra parte, la fluorescencia de GFP es sólo parcialmente sensible a los cambios en el pH, y permanece detectable dentro de la vacuola lumen 20,21. Por consiguiente, la fluorescencia de la etiqueta GFP persiste en la vacuola mucho después de que el resto de la carga se ha degradado, y toda la cuantificación basada en células de la intensidad de la carga puede ser inexacto debido a la fluorescencia de GFP a largo plazo en la vacuola.
Con el fin de superar los inconvenientes de la fluorescencia GFP vacuolar, que previamente hizo uso de pH supereclipticluorin, una variante sensible al pH de GFP que fluoresce brillantemente a pH neutro, pero pierde la fluorescencia en ambientes ácidos, tales como el lumen de la vacuola / lisosoma 20,22,23. La colocación de una etiqueta pHluorin en la cola citoplásmica de cargas endocítica permite la visualización de las cargas en la membrana plasmática y en los endosomas tempranos, donde la etiqueta pHluorin permanece expuesto al citoplasma (Figura 1A). A medida que maduran los endosomas tempranos, el complejo endosomal clasificación exigida en los paquetes de transporte (ESCRT) maquinaria cargas localizadas en la superficie en vesículas que brotan en el lumen del endosoma, la generación de cuerpos multivesiculares (MVBs) 24. Para las cargas que se han incorporado en vesículas internas MVB, la etiqueta pHluorin mira hacia el lumen de la vesícula. vesículas MVB internos se acidifican; por lo tanto, cargas marcadas con fluorescencia pHluorin pierden en los endosomas tempranos a medida que maduran en MVBs 20. fusión subsiguiente de la MVB con la vacuola entrega los contenidos luminales MVBpara la degradación, las etiquetas y pHluorin permanecen apagados en el ambiente ácido del lumen vacuola.
Este documento proporciona una descripción detallada de los ensayos cuantitativos endocítica utilizando cargas con etiquetas pHluorin citoplasmáticos en la levadura. Las cepas que expresan cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar en ensayos cinéticos y / o de punto final, dependiendo de las propiedades y el tráfico de comportamiento de la carga específica. Además, algunos cargamentos de etiquetado pHluorin son susceptibles de métodos de análisis de alto rendimiento, incluyendo citometría de flujo. Es importante destacar que la etiqueta pHluorin es una herramienta versátil para el estudio de eventos endocítica en las células vivas, lo que permite la cuantificación de la endocitosis y la comparación de la función endocítica de tipo salvaje y cepas mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicaciones de la pHluorin para la cuantificación de eventos endocítica en células de levadura hace uso de cargas transmembrana en el que la etiqueta fluorescente está fusionada a la cola citoplasmática de la proteína (Figura 1A). Para los ensayos descritos aquí, son cargas con fluorescencia brillante cuando la etiqueta pHluorin se expone a ambientes neutros, pero se convierten en extinguió cuando la etiqueta se encuentra con pHluorin condiciones ácidas. Por lo tanto, un cargamento endocítica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
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