יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גירסאותיה משמשים כלים נרחב ללימוד לוקליזציה חלבון ודינמיקה של אירועים כגון שיפוץ cytoskeletal וסחר שלפוחי בתאים חיים. מתודולוגיות כמותיות באמצעות התכת GFP כימרי פותחו עבור יישומים רבים; עם זאת, GFP הוא מעט עמיד proteolysis, ובכך הקרינה שלה נמשכת ליזוזום / vacuole, אשר יכול לעכב כימות של סחר המטען במסלול endocytic. שיטה חלופית לכימות אנדוציטוזה ופוסט endocytic אירועים סחר עושה שימוש superecliptic pHluorin, וריאנט pH רגיש של GFP כי הוא הרווה בסביבה חומצית. היתוך Chimeric של pHluorin לזנב cytoplasmic של תוצאות חלבונים מטען הטרנסממברני בתוך ריסון של הקרינה על ההתאגדות של המטען לתוך הגוף multivesicular (MVBs) והסעה לבית לומן ליזוזום / vacuole. לכן, מרווה הקרינה vacuolar מקלה quantifiקטיון של אנדוציטוזה ואירועים מוקדם מסלול endocytic. מאמר זה מתאר שיטות באמצעות מטענים מתויגים pHluorin כימות של אנדוציטוזה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם מבחנים מבוססי אוכלוסייה באמצעות cytometry זרימה.

Introduction

סחר שלפוחי ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הזהות אברון ותפקוד בתאים איקריוטיים, והוא מכשיר מרכזי להסדרת הרכב חלבונים בממברנה של תאים סלולריים הפרט. על הממברנה הפלזמה, שילוב של שלפוחית ​​exocytic מספק חלבונים וממברנות חדשים אל פני השטח של התא, ואילו שלפוחית ​​שנוצרה באמצעות אנדוציטוזה להסיר קרום וחלבונים מפני השטח למחזור עקב או מיקוד אל ליזוזום. לפיכך, אנדוציטוזה חשוב ספיגת חומרים מזינה ועל תגובות הסביבה התאית. Exocytosis ו אנדוציטוזה מאוזנים להסדיר שטח הממברנה, וכדי לאפשר מחזור של חלבונים פגומים.

עיונים שמרים בתאי יונקים זיהו מספר רב של חלבונים המעורבים אנדוציטוזה, כמו גם מסלולים endocytic מרובים שמקדמים הפנמה של מטענים ספציפיים או מעשה שיש בהם בתגובה במגוון enתנאים סביבתיים. מסלול-למד הכי טוב הוא אנדוציטוזה מתווכת clathrin (CME), שבו clathrin אביזר cytosolic חלבונים להרכיב למבנה מעיל לייצב את שלפוחית ​​endocytic המתהווה. הניסויים cerevisiae Saccharomyces שמרים ניצני הניבו תובנות חשובות על הדינמיקה והסדר של גיוס חלבונים endocytic רבים ^1-3. יש לציין, כי מכונה CME הוא שמור ביותר בתהליך האבולוציה כזה שרוב החלבונים הקשורים CME בשמרים יש orthologs אדם; וכך, נבגי שמרים כבר כלי חשוב להבנת המנגנונים של אנדוציטוזה כי הם משומר אאוקריוטים גבוה. לדוגמא, מחקרים באמצעות שמרי ניצנים נקבעו כי היווצרות והתבגרות של מבני CME (המכונה טלאים יקטינו קליפת מוח כמו שמרים) כרוך הגיוס הרציף של חלבונים רבים, החל clathrin וחלבוני מתאם מחייב למשא ואחריו גיוס של אבזר endocytic נוסף חלבונים,הפעלת Arp2 / פילמור אקטין 3 בתיווך, וגיוס של חלבונים המעורבים ^1,2 scission שלפוחית. גיוס של חלבונים מכונים CME כדי קליפת מוח טלאים יקטינו הוא תהליך הורה מאוד וסטריאוטיפי, ואת הסדר המדויק של גיוס חלבונים רבים כבר נקבע ביחס לרכיבים אחרים של מכונות CME. חשוב לציין, מחקרים שנעשו לאחרונה אישרו צו דומה של גיוס חלבונים CME בבורות מצופה clathrin בתאי יונקים ^4.

בנוסף CME, סוגי תאים רבים להחזיק אחד או יותר מסלולי endocytic עצמאי-clathrin (CIE) המסתמכים על מנגנונים חלופיים לקדם היווצרות שלפוחית והפנמה מן קרום הפלזמה ^5-7. בשמרים, אנו לאחרונה זיהינו מסלול CIE אשר מנצל את Rho1 GTPase הקטן גורם חליפי נוקלאוטיד גואנין ההפעלה שלה (GEF), Rom1 ^8,9. Rho1 מפעיל את formin Bni1 לקדם פילמור אקטין ¹0,11, אשר נדרש עבור סוג זה של אנדוציטוזה עצמאית-clathrin בשמרים ^12. יתר על כן, המשפחה-arrestin α של חלבונים לגייס את האנזים היוביקוויטין Rsp5 לקדם ubiquitination מטען והפנמה עוקבות דרך CME ^13-17, וגם לקדם הפנמה מטענים דרך מסלול CIE, ואולי באמצעות אינטראקציה ישירה עם חלבונים המעורבים CIE ^18. מגוון מסלולי CIE קיים גם בתאי יונקים, כוללים מסלולי clathrin-עצמאי phagocytic המסתמכים על ortholog Rho1, RhoA ^9,19. תפקידו של RhoA ב יונקים CIE הוא הבין היטב; לכן, מחקרים בשמרי ניצנים עשויים לספק תובנות מכניסטית נוספים החלימו על CIE היונק.

כימות מדויק של אירועי endocytic יכול לספק מידע חשוב על התפקידים של חלבונים ספציפיים בויסות אנדוציטוזה, והוא יכול לחשוף את ההשפעות של מוטציות על הפנמת מטען או progression דרך מסלול endocytic. לשם כך, בשיטות ביוכימיות יכולות להיות מנוצלות כדי לפקח ספיג ליגנד או כדי למדוד את שיעורים של פירוק של חלבוני מטען endocytic. בתאים חיים, שילוב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גרסותיה כדי מטעני עניין מאפשר הדמיה ישירה של כלי רכב כבדים. עם זאת, מטענים מתויג GFP הם של שימוש מוגבל כימות של אנדוציטוזה כי GFP הוא עמיד בפני פירוק בתוך ליזוזום (או vacuole בשמרים). יתר על כן, GFP הקרינה היא רק רגיש באופן חלקי לשינויים ב- pH, ונשאר לזיהוי בתוך vacuole לומן ^20,21. כתוצאה מכך, הקרינה של תג ה- GFP נמשכת vacuole הרבה אחרי שאר המטען כבר מושפלת, ושלמי כימותים מבוססי תאים של עוצמת מטען עשויים להיות לא מדויקים בשל קרינת GFP לטווח ארוכה של vacuole.

על מנת להתגבר על החסרונות של GFP הקרינה vacuolar, אנחנו קודם לכן עשו שימוש pH supereclipticluorin, וריאנט רגיש-pH של GFP כי מאיר במאור ב- pH נייטרלי, אבל מאבד הקרינה בסביבה חומצית כגון לומן של vacuole / ליזוזום ^20,22,23. הצבת תג pHluorin על הזנב cytoplasmic של מטענים endocytic היתרי להדמיה של מטענים על קרום פלזמה על endosomes מוקדם, שבו תג pHluorin נשאר חשוף אל הציטופלסמה (איור 1 א). כפי endosomes מוקדם להתבגר, במתחם מיון endosomal הנדרש להובלה (ESCRT) מטענים משטח-מקומי חבילות מכונות לתוך שלפוחית כי ניצן לתוך לומן של אנדוזום, יצירת גופים multivesicular (MVBs) ^24. עבור מטענים כי שולבו שלפוחית ​​MVB פנימית, תג pHluorin פונה כלפי לומן השלפוחית. שלפוחית ​​MVB הפנימית acidified; וכך, מטענים מתויגים pHluorin לאבד קרינה על endosomes מוקדם כשהם מתבגרים לתוך MVBs ^20. ההיתוך הבא של MVB עם vacuole מספק את תוכן luminal MVBהשפלה, ותגיות pHluorin נשארים הרווה בסביבה החומצית של לומן vacuole.

מאמר זה מספק תיאורים מפורטים של מבחני endocytic כמותית באמצעות מטענים עם תגי pHluorin ציטופלסמית בשמרים. זנים להביע מטענים מתויג pHluorin יכול לשמש מבחני קינטית ו / או נקודות קצה, בהתאם להתנהגות נכסים וסחר של מטענים ספציפיים. בנוסף, כמה מטענים מתויג pHluorin ניתנים שיטות ניתוח תפוקה גבוהה, כולל זרימת cytometry. חשוב לציין כי תג pHluorin הוא כלי תכליתי עבור חוקר ענייני endocytic בתאים חיים, המאפשר כימות של אנדוציטוזה והשוואה של פונקציה endocytic ב wild-type ו זנים מוטנטים.

Protocol

1. פתרונות ומדיה הכן את המניות, מדיה צלחות הבאות: כדי להכין 10x YNB, לפזר 67 גרם של בסיס שמרים חנקן חסר חומצות אמינו ב 1 ליטר של מים. לעקר על ידי סינון דרך פילטר nitrocellulose 0.22 מיקרו…

Representative Results

לוקליזציה וכימות יציבים של חלבון מטען endocytic הפנים constitutively Ste3 על מנת להוכיח כי מטענים מתויג pHluorin יכול להיות מנוצל עבור כימות של אנדוציטוזה בתאים חיים, לוקליזציה של ה- GFP כימרי ו התכה pHluor…

Discussion

יישומים של pHluorin כימות של אירועי endocytic בתאי שמרים עושים שימוש מטענים הטרנסממברני שבו תג הניאון הוא קבע את זנב cytoplasmic של החלבון (איור 1 א). עבור המבחנים המתוארים כאן, מטענים הם פלורסנט במאור פנים כאשר תג pHluorin חשוף בסביבות ניטראליות, אבל להיות רווה כאשר תג pHluorin מפ?…

Materials

Adenine	Sigma	A8626-25G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)	BD	291920	Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Use for coating of chamber slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine	Acros	125121000	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine	Fisher	BP388-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan	Fisher	BP395-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine	Acros	140641000	Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)	Thermo Scientific	155411	Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil	Sigma	U0750-100G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens	Carl Zeiss		Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam	Cooke Corporation		Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source	Excelitas Technologies
Slidebook 5 software	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/